DNA甲基化作為表觀遺傳學研究的重要范疇，已經越來越受到研究者的關注。近些年來，隨著DNA甲基化與組蛋白甲基化的聯合作用機制、RNA干擾機制及去 甲基化機制的發現，使得DNA甲基化研究受到廣泛關注，從醫學領域擴展到動植物研究當中，同時在研究方法上也取得了很大的突破。現在用于DNA甲基化檢測 的方法大概有十多種，從應用上來分，大致可以分成兩類：全基因組甲基化分析及特異位點甲基化檢測。下面，我們就這兩大類檢測技術進行分析比較，以便于在實際的科研工作中進行選擇。

一、全基因組甲基化檢測技術

1. 基于芯片平臺的全基因組甲基化篩選

芯片平臺作為目前比較成熟的篩選工具，已經在很多領域有了相應的應用。多家芯片公司在DNA甲基化這塊兒有了相應的產品提供，其中應用最為廣泛的就 Agilent平臺和Illumina平臺，相應的產品包括Agilent Human CpG Island Microarray Kit，Infinium HumanMethylation27 BeadChip和Infinium HumanMethylation450K BeadChip。另外Roche NimbleGen和Affymetrix也有相應的芯片推出，但是NimbleGen的芯片今年下半年已經停產。

不同的芯片平臺，各自的實驗過程也是不一樣的。安捷倫前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術。將基因組DNA分成兩份，一份用來做 MeDIP，另一份作為對照。兩個樣品都標記熒光(富集的樣品用Cy5標記，對照用Cy3標記)，然后與芯片雜交。芯片上每個探針的Cy5/Cy3強度比 例顯示出該區域的甲基化程度。

安捷倫公司芯片平臺因其強大的eArray探針設計平臺，可以進行芯片的定制。在甲基化領域同樣適用。

Agilent平臺因為MeDIP技術本身的特點，都不能到達單堿基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate檢測技術卻做 得到。Illumina的Infinium甲基化檢測技術來源與前期的SNP檢測，采用的是單堿基延伸的原理。分析利用兩個位點特異的探針檢測這些序列差 異的位點，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設計的，而另一個是為未甲基化位點(U磁珠類型)設計的。探針的單堿基延伸摻入了一個標記的ddNTP， 它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定檢測位點的甲基化水平。Illumina公司早期推出的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點。這款芯片在醫學領域有廣泛的應用，除了和腫瘤相關的甲基化篩選之外，也能用于其他疾病相關甲基化檢 測。因此對這款產品，研究者給予了很高的評價，目前此產品已停產，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過45萬個甲基化位點，實現了基因區域和CpG島的全面覆蓋。此外，還包括CpG島之外的CpG 位點，在人類干細胞中鑒定出的非CpG甲基化位點，以及腫瘤和正常組織中差異表達的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格，讓它成為進行全基因 甲基化篩選的有力武器。

相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析技術更適合中通量的篩選及驗證研究，它以以矩陣微珠芯片(Sentrix Array Matrix(SAM)）形式分析48至384個用戶指定的CpG位點。首先，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA 與分析oligo混合，oligo與未甲基化位點的U互補，或者與甲基化位點的C互補。雜交之后，引物延伸，并連接上位點特異的oligo來產生通用 PCR的模板。最后，用標記的PCR引物生成可檢測的產物。據Illumina的產品專家介紹，其產品的最大優勢在于單個CpG位點的分辨率。其它分析將 甲基化定位在一段區域，而通過Illumina分析，你能精確測定某個CpG位點的甲基化水平。

2. 基于高通量測序平臺的甲基化圖譜分析

隨著二代測序技術的告訴發展，測序成本大幅度下降，使得真正實現全基因組甲基化分析的研究成為可能。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經陸續有多個物種的甲 基化圖譜構建完成。研究者將傳統的DNA甲基化檢測方法，如亞硫酸氫鹽轉化與高通量測序相結合，可以實現單堿基精度的甲基化圖譜的構建。此外將成熟的 MeDIP技術與二代測序相結合，可以快速有效地尋找基因組上的甲基化區域，從而比較不同細胞、組織、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。因此 該技術也特別適用于大樣本量的疾病表觀研究。

第三代測序技術的出現，更是讓甲基化的直接測定成為可能。一年前，美國Pacific Biosciences公司利用獨有的單分子實時(SMRT)測序技術，直接測定了DNA的甲基化。這項成果發表在《Nature Methods》雜志上。

二、特異位點甲基化檢測技術應用比較

1.甲基化特異性PCR（MS-PCR）

DNA在亞硫酸氫鹽作用后，DNA CpG若無甲基化，則序列中的C改變為U，若有甲基化則保持不變，因此從理論上講，用不同的引物做PCR，即可檢測出這種差異，從而確定基因有無CpG島 甲基化。因此根據目的基因修飾前后的改變，就可以相應設計M和U引物，有時我們需要設計兩輪引物。

這種方法靈敏度高，無需特殊儀器，因此經濟實用，是目前應用最為廣泛的檢測方法。不過也存在一定的局限性，預先需要知道待測片段的DNA序列，引物的設計非常重要。另外，亞硫酸氫鹽處理也十分關鍵，若處理不完全則可能導致假陽性的出現。

2. 亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)

這種方法一度被認為是DNA甲基化分析的金標準。它的過程如下：經過亞硫酸氫鹽處理后，設計引物進行PCR擴增目的片段，并對PCR產物進行克隆測序，將 序列與未經處理的序列進行比較，判斷CpG位點是否發生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但因為涉及到 測序，其結果準確但要求克隆時所挑克隆較多，操作繁瑣，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依賴于挑選克隆的數目，因此這種方法只能算得上是一種半定 量的技術方法。

目前一般會先用BSP找到甲基化位點，然后根據甲基化位點設計MSP引物，進行相應PCR條件摸索，以用于大量樣本的篩選。

3.甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)

通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉變成熔解曲線的差異，因此DNA樣本經過亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可 通過熔解曲線分析來發現。使用該方法進行甲基化分析僅需一對引物，相對簡單，不過這種方法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，并且在 進行實時定量PCR過程中，需要使用飽和的熒光染料。利用MS-HRM技術進行甲基化檢測只能對檢測片段整體甲基化情況進行分析，并不能明確每個CpG位 點的甲基化狀態。因此這種技術適用于大量樣本的檢測，篩選出感興趣的CPG位點，然后利用其他方法進行單個位點的精確檢測及甲基化程度的精確定量。

4. 聯合亞硫酸氫鈉的限制性內切酶分析法（COBRA）

這種方法是將亞硫酸氫鹽處理與酶切相結合來進行甲基化檢測。DNA樣本經亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴增。擴增產物純化后用限制性內切酶（BstUI） 消化。若其識別序列中的C發生完全甲基化(5mCG5mCG)，則 PCR擴增后保留為CGCG，BstU I能夠識別并進行切割；若待測序列中，C未發生甲基化，則PCR后轉變為TGTG，BstUI識別位點丟失，不能進行切割。這樣酶切產物再經電泳分離、探 針雜交、掃描定量后即可計算出原樣本中甲基化的比例。

這種方法最大的優點就是相對簡單，可進行快速定量，且需要的樣本量少。然而，它的局限性也十分明顯，只能獲得特殊酶切位點的甲基化情況，且陰性結果并不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能。

5. 熒光定量法（Methylight）

這種技術是在MSP技術上發展起來的，在MSP擴增過程中利用熒光染料進行定量。TaqMan? 探針法的應用使得該技術具有更高的精確性。其原理與SNP檢測類似，針對亞硫酸氫鹽處理之后的DNA片段，在甲基化位點上會存在單堿基的差異，根據這種差 異進行探針設計，隨后進行實時定量PCR，就能夠檢測甲基化的差異。這種方法最大的優勢在于其高敏感性和較高通量，且無需在PCR后電泳、雜交等操作，減 少了污染和操作誤差。但是TaqMan? 探針訂購費用較高，適用于少數位點大量樣本篩選。

6. 焦磷酸測序(Pyrosequencing)

隨著技術的不斷改進，現在認為焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）是甲基化檢測新的金標準。焦磷酸測序作為一種新的序列分析技術，能夠快速地 檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。在序列延伸過程中，根據C和T的摻入量來定量確定單個位點的 C-T 比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測，并給出精確的甲基化程度的數據。

QIAGEN公司在焦磷酸測序的應用上具有明顯的優勢，目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應用。PyroMark Q24 的強項在于可對多達24個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應用更適合在PyroMark Q96 ID 上進行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量最大化可能會使實驗成本變得很高。而PyroMark Q96 MD裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準確測序。這些不同平臺的推出，對于我們實際研究提供了更有效的檢測手段。

雖然焦磷酸測序可以進行單個位點甲基化程度的精確定量，但是目前來看，測序的片段長度還比較短，只有一百多bp，其中有效長度約為60bp。

以上是對幾種常用的特異位點甲基化檢測方法進行了介紹及比較，還有一些檢測技術是在常用的檢測手段上進行優化或者將不同的方法進行結合應用，比如以MSP 方法為基礎，發展了SMART-MSP技術，該技術利用定量技術對MSP擴增過程進行檢測，同時后續結合HRM技術來分析甲基化差異。此外，利用質譜平臺 進行甲基化檢測的有MALDI-TOF技術，可以對甲基化進行精確檢測并能進行高通量篩選。從對這些技術的比較分析來看，沒中檢測技術都有各自的優點，并也存在一定的局限性，研究者可以根據自己的實際研究情況進行選擇。