各位科研界的小伙伴們，大噶好。小編先給大家講個故事，英國有這樣一對可愛的同卵雙胞胎小姐妹——奧利維亞和伊莎貝拉，長得幾乎一毛一樣，但健康狀況卻截然不同。2005年7月，可憐的寶貝奧利維亞患上急性白血病，而伊莎貝拉身體卻沒有任何異樣。后來奧利維亞在醫生掰掰的精心治療下完全康復，全家人歡天喜地，卻獨留醫生們在科研的狂風暴雨中徘徊多年，怪我咯！？醫生們非常困惑，同卵雙胞胎擁有幾乎完全一樣的遺傳信息，為甚么一個患病另一個完全正常膩？后來 ，人們才知道原來是“表觀遺傳修飾”在作怪。

某度顯示，表觀遺傳學指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，主要包括組蛋白修飾、轉錄因子調控、DNA甲基化、基因沉默、RNA編輯等。簡單來說，就是——環境也可以改變基因。那么小伙伴們可能會問，什么樣的環境因子會導致生命機體改變呢？發生這些變化的原因又是啥呢？別急，小編這就教你如何利用高科技武器（高通量測序技術），逐個擊破我們對表觀遺傳修飾的困惑。本期，我們先修煉修煉高IF文章（轉錄因子調控類）不可或缺的ChIP-seq吧！

 ChIP-seq修煉秘籍

該秘籍一共分為七重，幫助您從ChIP-seq小白，修煉成ChIP-seq大白，開個玩笑。好啦，讓我們操練起來吧！

第一重：ChIP-seq是個神馬鬼？

染色質免疫共沉淀技術（Chromatin  Immunopre-cipitation，ChIP），在生理狀態下把細胞內的 DNA 與蛋白質交聯在一起，通過超聲處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA 片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉錄調控的 DNA 片段。ChIP-seq，顧名思義，就是將ChIP富集到與蛋白結合的DNA片段進行高通量測序啦。

ChIP-seq實驗流程

第二重：ChIP-seq究竟有啥用？

ChIP-seq可用來分析全基因組范圍內DNA結合蛋白結合位點、組蛋白修飾、核小體定位或DNA甲基化等。該方法可以應用到任何基因組序列已知的物種，能確切得到每一個片段的序列信息，并可基于多個樣品進行差異比較分析。具體的分析可見下圖：

ChIP-seq分析流程

第三重：ChIP-seq怎么設計實驗對照？

想要搞懂這個問題，我們要先明確幾個概念：

1）input：樣本經過超聲，但是沒有進行ChIP，包含樣本超聲后總DNA，可以進行電泳，檢測超聲效果，同時，可以與最后ChIP樣本進行比較，判斷ChIP的效率（如果用同一引物進行PCR，ChIP 組和 input 組亮度差不多，說明 ChIP 效率高，樣本中所有的目的基因片段都被ChIP下來了，反之，說明效率低，實驗條件有待改進）

2）陰性對照：用普通的IgG做為抗體，理論上不會ChIP下來任何DNA片段，但是由于非特異結合，或者實驗過程中，沒發生結合的DNA清除不完全，可能也會出現條帶。（個人認為這組最理想的結果當然是沒有條帶，但是如果有一條淡淡的條帶，也無妨）。

3）陽性對照：一般用anti-RNA Polymerase II抗體，因為RNA Polymerase II是通用轉錄因子，在所有細胞中都能結合基因（當然是在該細胞中表達的基因，所以為了保證陽性對照有效，一般選擇陽性對照的引物是根據管家基因設計的）的核心啟動子區，因此，理論上ChIP后PCR都會有條帶，也用于判斷ChIP的效率。

 一般情況下，我們建議ChIP-seq至少要對input組和實驗組進行測序。

第四重：ChIP-seq基礎概念掃盲

要想看懂ChIP-seq文獻，以下幾個概念您可必須要知道哈。

峰(peak)

a) 定義：由于超聲打斷的隨機性，所以包含某個位的超聲片段可能有多條，相互間起止點不同，這些片段被富集，片段間的重疊區域稱為“峰”，即DNA與蛋白相互結合的位點。為了剔除假陽性，以沒有經過免疫沉淀的超聲樣品作為負對照。

b) 峰型：不同的DNA結合蛋白在基因組上的分布模式是不同的，具體體現于ChIP-seq峰形的不同

轉錄因子的峰型：尖銳狀（sharp peak，即信號高度集中）

組蛋白標記的峰型：連綿狀（broad peak，信號跨越一定范圍），

RNA聚合酶II峰型：上述兩者兼有

c) 搜峰軟件：MACS、Peak Finder、Cis Genome、SICER

peak關聯基因

a) peak與受調控基因的對應：調控因子不僅以線性方式調控臨近基因，還可以調控距離較遠，甚至是不同染色體上的基因，目前大多軟件搜索的是以線性方式調控的臨近基因。

b) 搜峰軟件：Peak Analyzer、Peak Annotator 、Peak Splitter

Motif （轉錄因子）

1）TFBSs (Transcription factor binding sites)

轉錄因子結合位點通常是指基因組上，供轉錄因子結合的5-14bp的DNA序列 

2）motif

轉錄因子與被調控基因是多對多的關系，一個轉錄因子可以識別相似的TFBSs ，這些TFBSs通常可以一個module表示，即motif

3）cis-regulatory module (CRM)

真核生物中，多個TFBSs往往集中于一段短DNA序列 (長度一般不超過200pb)中，該序列稱為CRM

第五重：修煉成功典范

哥哥和弟弟是雙胞胎，但是哥哥好像比弟弟胖一些，為蝦米？答案在此。我們進餐后，消化系統就會快馬加鞭的消化食物，維持我們正常需要，但是消化能力也是因人而異的呢。下面就以肝臟代謝脂類為例，解釋表觀遺傳的強大作用。膽汁酸是膽汁的重要組成部分，與脂質代謝密切相關。在Genome Research上發表的文獻里，主要介紹了一種纖維細胞生長功能因子FGF-19可以導致甾醇生物合成過程沉默。

首先，FGF--19和Veh處理小鼠肝臟，ChIP-seq尋找SHP的潛在靶基因，得到共同富集和不同富集的峰信號（a）。但有意思的是無論FGF-19還是對照處理，這些峰信號大部分都臨近啟動子區，也就是說SHP對轉錄因子的臨近啟動子區具有偏好性（b、c）。

圖1 不同處理下SHP結合區域統計

既然這些峰信號都臨近啟動子區，而轉錄因子一般都是位于啟動子區的，是否這些基因與轉錄因子存在功能相關還是僅僅是巧合呢？基因GO富集分析，發現大部分與代謝通路相關，同時與已知轉錄因子存在功能相關性。

已知SREBP-2是甾醇合成中主要轉錄激活因子，而SHP和SREBP-2也存在交集（a），那么是否SHP也參與甾醇合成呢？通過ChIP-seq發現這些轉錄因子確實會在FGF19處理后富集（b），同時轉錄水平和蛋白水平也證明SHP可以調控甾醇合成（c、e）。

圖2 SHP參與甾醇的合成及運輸信號通路

SHP和SREBP-2都可以調控甾醇合成，那他們是否可以通過某種聯系共同調控甾醇的合成呢？研究表明SHP和SREBP-2確實存在功能相關性。FGF19處理小鼠肝臟后，增強SHP與SREBP-2功能聯系從而導致甾醇合成及運輸過程沉默。

圖3 FGF增強SHP和SREBP-2功能聯系最終導致表觀沉默

小結：本文通過ChIP-seq技術，得出FGF19可以調控膽汁酸合成和進餐過程，很適合研究表觀遺傳的童鞋仔細研讀呢。

參考文獻：Young C K, Sangwon B, Yang Z, et al. Liver ChIP-seq analysis in FGF19-treated mice reveals SHP as a global transcriptional partner of SREBP-2. Genome Biology, (2015) |DOI: 10.1186/s13059-015-0835-6

第六重：測序前需知

樣品類型：ChIP之后的DNA

樣本要求：濃度 ≥5 ng/μl（TBS-380），總量≥100ng

推薦測序量（基因組大小，結合位點多少）：

10M ~ 20M reads：轉錄因子的DNA結合位點和基因組與組蛋白修飾相關的位點通常落在特定的、狹窄的區域（6~20 bp），位點的個數大約有1萬左右 

60M reads：蛋白與DNA有更多的結合位點（比如 RNA Pol II）或者結合的位點比較寬（比如大部分的組蛋白修飾） 

項目周期：45天 

第七重：活學活用

美吉愿與您聯手，組您在ChIP-seq的路上越走越遠！期待您的成果展示呦！

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