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導語 溫馨提示，視頻長約6分鐘，建議在WiFi環境下觀看 SDS-Page電泳主要利用聚丙烯酰胺的分子篩效應分離蛋白質和核酸，SDS-PAG蛋白質電泳分析可從蛋白質亞基分子量的大小就分離蛋白質。 幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所有條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并進可能減少其相互間的聚集，最常用的就是SDS-PAGE電泳技術，關于大家在此過程中經常遇到的問題進行一些討論： Q：SDS-PAGE電泳的基本原理? A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關，在達到飽和的狀態下，每克多肽可與1.4g去污劑結合。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。 Q：配膠緩沖液系統對電泳的影響? A：在SDS-page不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9;而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低;而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。 所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。 Q：樣品如何處理? A：根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100μl樣品緩沖液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。 Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用? A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關; 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris-HCL系統，具體作用后面介紹; TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固; 十二烷基硫酸鈉(SDS)：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。 Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑? A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。 Q：“微笑”(兩邊翹起中間凹下)形帶原因? A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗。 Q：“皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原因? A：主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 Q：為什么帶出現拖尾現象? A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 處理辦法：加樣前離心;選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時間過長，重新配制;降低凝膠濃度。 Q：為什么帶出現紋理現象? A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。 處理辦法：加樣前離心;加適量樣品促溶劑。 Q：什么是“鬼帶”，如何處理? A：“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端(有時在濃縮膠中)的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑;或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 Q：為什么溴酚藍不能起到指示作用? A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。 處理辦法：更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。 Q：為什么電泳的條帶很粗? A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。 處理辦法：適當增加濃縮膠的長度;保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7);適當降低電壓; Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢? A：這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反;b.外槽液過少;c.電泳槽底部的絕緣體未去掉(比如倒膠用的橡膠皮)。 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎? A：這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致;后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關，在達到飽和的狀態下，每克多肽可與1.4g去污劑結合。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。 蛋白樣品，SDS-PAGE loading buffer，PBS，Tris-Hcl (PH 8.8)， Tris-Hcl (PH 6.8) ，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%過硫酸，5×SDS-PAGE電泳緩沖液，考馬斯亮藍R-250染色液，脫色液。 一、凝膠配置 1．分離膠的配制
（1）找出配套的膠板，用擦鏡紙擦干凈，并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏； （2）若膠板不漏水，就進行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中，混勻（1mm的膠板，一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%，但濃度也要視情況而定。蛋白越小，膠的濃度越大）； （3）將膠板中的水倒掉，并用濾紙吸干水分（不要將濾紙塞到膠板底部）； （4）小燒杯中再加入TEMED，混勻。（TEMED可使膠凝固，所以最后加）； （5）灌膠：混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下，防止產生氣泡； （6）用水將分離膠壓平（用水灌滿，同時加水時要緩慢加入，防止把膠吹起）。 2．濃縮膠的配制
（1）待分離膠與水中間形成明顯的橫線，即分離膠凝固。隨后進行濃縮膠的配制，依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中； （2）將分離膠上層的水倒掉，并用濾紙吸干水分（盡量不要把濾紙插入）； （3）小燒杯中再加入TEMED，混勻； （4）灌膠。然后插入梳子； （5）把制膠器倒過來，膠仍然不會往外流，或可以明顯看出梳子中兩個齒之間的膠面明顯凹下去，說明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內，并在電泳槽內加入SDS-PAGE電泳緩沖液，把膠浸泡一段時間，時間越長越好（防止梳子與膠相連，或膠因濕度不夠而萎縮）； （6）點樣時，再把梳子拔出來，拔時動作要輕，防止膠齒被拔斷。 二、SDS-PAGE電泳 1、調膠：拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調整齒的位置（使它們都平行）。 2、點樣：用20μL的小槍頭，吸煮過的樣品10μL，對準膠孔點樣，注意不要把樣品點在外面。使用適當的分子量蛋白marker。 3、電泳：電泳儀正負極接好，打開電源。濃縮膠：電壓 low 100V 分離膠：電壓 high 150V。 4、卸膠：等膠內的所有的藍色都跑出去，電泳停止，一般時間為1-2小時左右。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開，膠的濃縮膠部分割除； 5、染色：放入考馬斯亮藍R-250染色液中進行常溫過夜染色； 5、脫色：將過夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進行脫色，直到背景發白。 一、3×SDS-PAGE loading buffer的配制
1、將除BPB以外的藥品完全溶解。SDS常溫下很難溶解，可以在37℃水浴溶解。完全溶解后，再加入BPB，進行溶解； 2、把溶好的buffer分裝到1.5ml的離心管中，1ml/管，常溫放置； 3、使用前，每管加入30μL巰基乙醇。 注意事項：巰基乙醇為危險品，加入的過程在通風櫥中完成，并且帶好手套。 二、10×PBS的配制
1、用去離子水將以上藥品進行溶解；（溶解的非常慢，可能需要過夜） 2、調PH值到7.2，用0.4μm的濾膜過濾。常溫保存； 3、工作時用的是1×PBS。 三、1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制
1、用200ml去離子水將Tris溶解。 2、用濃鹽酸調PH值到8.8。 3、調好PH的Tris-Hcl定容到250ml。 4、0.4μm的濾膜過濾，常溫保存。 注意事項：Tris的緩沖能力很強，調PH值時，費些時間，但不要調過。 四、1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制
1、用200ml去離子水將Tris溶解； 2、用濃鹽酸調PH值到6.8； 3、調好PH的Tris-Hcl定容到250ml； 4、0.4μm的濾膜過濾，常溫保存。 五、30%丙烯酰胺的配制
1、把藥品用去離子水溶解后定容到250ml； 2、用濾紙過濾，放在棕色瓶子中，4℃保存。 注意事項：兩種藥品有毒性，配制過程要帶手套和口罩。 六、10%SDS的配制 1．1g SDS加入10ml去離子水進行溶解； 2．分裝到1.5ml離心管中，-20℃保存。 七、10%過硫酸銨的配制 1．1g 過硫酸銨加入10ml去離子水進行溶解。 2．分裝到1.5ml離心管中，-20℃保存。 八、5×SDS-PAGE電泳緩沖液的配制
將以上藥品用去離子水溶解后定容到1L，常溫保存。工作時用的是1×SDS-PAGE電泳緩沖液。 九、考馬斯亮藍R-250染色液的配制 1、往1g考馬斯亮藍R-250中加入250ml異丙醇，在磁力攪拌器上攪拌六小時以上； 2、加入650ml去離子水，磁力攪拌器攪拌過夜； 3、再加入100ml冰醋酸進行溶解，磁力攪拌器攪拌； 4、在通風櫥內用濾紙進行過濾。常溫保存。染色液只能反復用兩次。 注意事項：在磁力攪拌器上攪拌時，要把容器封口。 十、脫色液的配制
常溫保存。 |
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