1. 在無外泌體的血清中培養細胞，因此，任何細胞培養液中添加的血清在4 ° C下離心120，000xg離心過夜后才能使用。 

2. 將細胞懸液錐形管。 

3. 在4 ° C沉淀細胞，離心10分鐘300 XG。 

4. 轉移上清到超速離心機管，如果不徹底加入PBS。

5. 樣品16 500 XG離心20分鐘，4 ° C至進一步去除細胞和細胞殘骸。 

6. 通過0.2微米過濾除去大于200納米的顆粒來過濾上清液。 

7. 過濾上清液轉移到新的超速離心機管和120 000 XG ，在4 ° C下120，000xg離心70分鐘。

8. 棄上清。 

9. 重懸：這個緩沖液取決于以下目的，例如，裂解液用于蛋白質和RNA的分離，PBS是用于電子顯微鏡和流式細胞儀和功能的研究。 

從視頻大家可以看到，這種塑封管挺不方便的，一會要封，一會兒要剪，所以實際，很多都是使用以下這種pc管。

注;外泌體也可以從不同的體液，如血漿，使用相同的過程，作為細胞培養基中分離。對于粘性液體，它可能是必要的，用PBS稀釋的樣品離心和過濾步驟之前的。在上述5點的離心速度，它可以增加至29 500 XG，第7點中的離心可以延長至90分鐘。 

1. 為了進一步消除污染蛋白，在4 ° C下離心120 000 XG 70分鐘，至重新沉淀外泌體富集在PBS中

2.取蛋白分離和總蛋白測定樣品的小等分。確保只有一小部分樣品裂解和蛋白質測量，并保存完整的外泌體，PBS溶解，單獨的冰或在-80℃為進一步的實驗。

3.將一滴約10μg的外泌體蛋白在PBS中重新懸浮在PBS中。然后，用鑷子輕輕地將Falvar碳涂層鎳網格放置在每個滴的頂部30-60分鐘。確保柵格定位在涂層側面對含有脫落物的外泌體。

4.在Parafile上滴三滴PBS，每滴30μL，然后依次將網格定位在PBS滴的頂部來清洗網格，并在兩者之間使用吸收紙。輕輕地將吸收紙輕輕地放在格柵的側面，而不與涂布區域接觸。

5.將樣品滴入2%聚多聚甲醛上，將網格放置10分鐘。

6.在用合適的抗體進行免疫染色之前，重復第4點的洗滌步驟。常用的抗體是抗CD63和抗MHC II類。電鏡檢查也可以進行，而不用免疫染色，因為外滲體可以只根據大小和形態來鑒定。然而，我們建議評估膜蛋白的大小、形態和存在，以進行更確鑿的驗證。

7.將網格轉移到選擇的初級抗體的30μL滴中，孵育40分鐘。通過重復點4洗滌，但使用0.1%的牛血清白蛋白PBS溶液代替PBS。

8.重復第7點，但與10納米金標記的第二抗體和單用PBS洗。 

9.在樣品上滴入2.5%的戊二醛后固定樣品，然后將格子放在滴狀物上溫育10分鐘。重復洗滌點4，但使用五滴去離子水代替三滴PBS。

10.將樣品中添加2%的醋酸鈾酰滴到藥膜上，將培養液滴在液滴上15分鐘。

11.將0.13%的甲基纖維素和0.4%的乙酸鈾酰滴入膜中，嵌入樣品，并在滴頂部孵育網格10分鐘。

12.用吸收紙輕輕地除去多余的液體，然后將格子放在有涂層的一面朝上的紙上，讓紙風干5分鐘。

13.用電子顯微鏡檢查制劑或將柵格儲存在柵格箱中以備將來工作。

由于外泌體太小，不能用目前的流式細胞儀檢測，因此有必要首先將外源體結合到抗體包被的珠子上（圖1）。這些珠子既可以作為現成產品購買，也可以在實驗室中用抗體選擇。根據外體細胞的來源，不同的抗體可以結合到珠子上，珠子可以是磁性的，也可以是乳膠狀的。我們目前使用抗MHC II類或抗-CD63涂層珠用于此分析。

1.使用自制抗體包膜珠，用4μm乳膠珠涂覆抗CD63抗體。將25μL的4μm乳膠粒（30x 106粒）在100μLMES緩沖液中洗兩次，3000x g洗15-20分鐘，再溶于100μLMES緩沖液中。用相同體積的MES緩沖液制備體積等于12.5μg抗體的抗體混合物。在抗體混合物中加入珠子，并在室溫下在夜間攪拌。用PBS(3000x g，20分鐘)將抗體包被珠洗三次，然后將顆粒溶解在100μL的儲存緩沖液中(最終濃度為300000珠/μL)。

2.對于每個樣品(每個抗體)，繼續以每~10萬個抗體包被的珠子至少等于30μg(在PBS中溶解的完整的外體蛋白)的體積。

3.在4°C下，在溫和的運動下，在300μL PBS的總體積下孵育外體和珠。

4.加入300μl 200 mL甘氨酸，孵育30分鐘。

5.在洗滌緩沖液（PBS中1-3%血清）中洗滌兩次外泌體珠配合物，600×g 10分鐘。

6.在4℃下用50μLIgG抗體孵育外泌體-珠復合物，在洗滌緩沖液中洗滌外泌體-珠復合物兩次，如步驟5所述。

7.將90μL的洗滌緩沖液和10μl的選擇性抗體（理想情況下是抗CD9、抗CD63或抗CD81）加入外體珠復合物中，在溫和運動下孵育40分鐘。如步驟5所述，在洗滌緩沖液中洗滌兩次外泌體珠配合物。

8.添加300μL洗滌緩沖液，用流式細胞儀采集數據。如上所述，可以使用不同的珠子，如在協議或磁珠中描述的乳膠珠。如果使用磁珠代替，請注意，協議略有不同。不需要阻塞步驟(點4)，并且通過將管置于磁性支架中而不是通過離心進行洗滌。用于“自制”抗體包被珠的儲存緩沖液在PBS中含有0.1%甘氨酸和0.1%疊氮鈉，pH為7.2。重要的是，確保使用流式細胞儀洗滌緩沖液（PBS中1-3%的血清）的耗盡外泌體血清，以避免任何血清外體污染分析。

注意：當使用抗體偶聯珠進行外泌體特征化時，重要的是要承認它只是被分離和特征化的特定亞群，對所使用的抗體具有特異性。

 Western blot是一種已經建立的方法，我們不會詳細介紹該方法本身，而是在Western blot和所使用的不同抗體之前，著重于合適的蛋白質分離的重要性。

1.在選擇的蛋白質裂解緩沖液中溶解外泌體顆粒，渦流。為了進一步溶解外泌體，可將樣品在水浴3×5分鐘內用渦流混合在其之間進行超聲處理。最后將樣品離心，室溫下離心13000×5分鐘，并將上清液轉移到一個新的Ep管中。

2.用選擇的方法測定總蛋白，每孔裝載20-50μg蛋白質。

3.通過凝膠電泳和電烙印分離和轉移蛋白質。

4.在對富含外泌體的蛋白質進行免疫染色之前，阻斷并洗滌膜。

5.通過化學發光、數字成像系統和分析軟件檢測特異性蛋白。

由于沒有外泌體特異性標記，富含來自所有不同細胞來源的外源體的蛋白質通常用于外泌體檢測。這些蛋白例如跨膜蛋白(例如CD9、CD63和CD81)和涉及多泡生物發生的蛋白(例如Tsg101和alix)。其他在外泌體中也普遍檢測到的蛋白質是Flotillin、Hsc70和不同的rab蛋白等。然而，在外泌體中也發現了細胞特異性蛋白，如A33(腸上皮細胞)、CD3(T細胞)和MHC II類(抗原呈遞細胞)。因此，取決于從檢測到的標記物釋放的外來細胞的細胞類型可能有所不同。

由于細胞的其他隔室也可以產生囊泡，因此還建議確定來自這些隔室的蛋白質的存在，例如內質網(例如calnexin和Grp78)和高爾基體(例如GM130)。因此，缺乏這些蛋白質表明沒有或幾乎沒有污染的囊泡中的其他研究的樣品。

在選擇的RNA裂解緩沖液中溶解外泌體顆粒并進行RNA提取。不同的RNA提取試劑盒可根據下游的實驗，但基于列的方法提供樣品與一個廣泛的RNA。我們目前使用mircury RNA提取試劑盒由Exiqon，但其他組件可能適合手頭的科學問題。

當進行RNA分離時，在無RNase環境中工作是很重要的。因此，使用核酸和無核酸酶的移液管提示，同時清除工作臺和設備，不受污染物和RNase的影響。

1.RNA的分離，利用mircury RNA提取試劑盒，外泌體顆粒在350μL裂解液進行15秒的混合渦。

2.加入200μL的95%乙醇和渦流混合10秒。

3.在收集管中放置柱，并將裂解的外泌體轉移到柱上，離心1分鐘，在14×000克。

4.添加400的μL洗液含有胞外體RNA和離心1分鐘14 000 x g柱洗三次

5.離心柱2分鐘14 000 x g確保柱干燥的地方干柱在無RNA酶的Eppendorf管。

6.將50μL洗脫緩沖液加入到柱中，在200×g下離心2分鐘，然后在14×000×g下1分鐘。

7.繼續分離RNA或儲存在80°C。

8.對提取的總RNA的檢測和分析外泌體，使用Agilent 2100生物分析儀與

RNA 6000納米或RNA 6000 Pico試劑盒。

外泌體太小，不能用現有的流式細胞術方法檢測，因此在分析之前被附著在抗體包被的珠子上（圖1）。

由于外泌體復合物可以聚集，流式細胞儀散點圖可以包含不同種群的單珠、雙珠和三珠（圖2A）。箭頭表示進一步分析的單個珠子。圖2B顯示了CD63陽性的單珠外泌體細胞群體與其同種型對照相比。

由于外泌體的小尺寸，它們只能用電子顯微鏡直接觀察，而不是通過光學顯微鏡觀察。外泌體的典型形態特征是圓形和30～100nm大小的膜囊泡。在圖3中，電子顯微鏡照片顯示用金標記的CD63抗體（箭頭所示）和非免疫染色的外泌體（B）免疫染色的外泌體（A）。

為了確定分離的囊泡確實是外泌體蛋白并進一步鑒定外泌體蛋白，通常使用蛋白質印跡。圖4顯示了鈣內毒素缺失的內質網標記物。這表明內質網囊泡的污染很小。此外，圖4顯示了CD81在外體中的存在，這是通常在外泌體中富集的四聯棘素。

細胞RNA主要含有核糖體RNA（rRNA），在生物分析儀分析中，它被認為是18S和28SrRNA亞基的兩個顯著峰（圖5A）。然而，由于外體缺乏兩個rRNA峰（18S和28S），并且富含短RNA，如mRNA和miRNA（圖5B），因此外泌體RNA的分布不同。