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帶你讀懂ChIP-seq的優點和局限

 蘿卜漲價了 2019-02-28

ChIP-seq或染色質免疫沉淀和測序是一種技術,允許研究人員通過在全基因組范圍內繪制蛋白質-DNA相互作用和表觀遺傳標記來理解轉錄調控。與以前的方法相比,ChIP-seq具有幾個優點,例如ChIP芯片,但與所有技術一樣,ChIP-seq也有其局限性。

ChIP-seq

ChIP-seq是下一代測序的首批應用之一,該測序是在2000年代中期開發的。其前體ChIP芯片通過與微陣列雜交分析片段,顯示DNA-蛋白質相互作用。使用下一代測序的ChIP-seq可以直接測序目標片段,而不是將它們雜交在陣列上。
簡而言之,ChIP-seq涉及用甲醛處理細胞以在體內將結合蛋白與DNA交聯。然后使用超聲處理將染色質剪切成200-600bp范圍內的較小片段。
對靶蛋白特異的抗體用于免疫沉淀DNA-蛋白質復合物。最后一步涉及逆轉交聯和DNA的釋放,其在任何下一代平臺上測序以鑒定蛋白質結合的序列。

ChIP-seq的優點

與ChIP芯片相比,ChIP-seq技術可實現單堿基對的分辨率,更少的偽像,更好的覆蓋范圍和更大的動態范圍。優異的堿基對分辨率是最重要的優勢之一,因為陣列在雜交過程中具有基本的不確定性,這限制了分辨率。雖然ChIP芯片的分辨率因陣列而異,但通常在30-100bp范圍內,但ChIP-seq具有單核苷酸分辨率。
繞過雜交過程對ChIP-seq有額外的好處。在ChIP芯片的雜交過程中,不完全匹配的序列之間可能存在交叉雜交,這增加了信號噪聲。由于直接測序方法,ChIP-seq本質上不受這些噪聲源的影響。但是,可以使用ChIP-seq接收一些GC偏差。
與其他方法相比,ChIP-seq提高了分辨率。陣列的強度信號可能不完全是線性的,并且陣列的動態范圍限制在飽和點之外。這導致它們在ChIP芯片中被遮擋,但不是ChIP-seq實驗。與ChIP芯片的檢測下限相反,ChIP-seq沒有有限的動態范圍。
下一代測序技術意味著基因組覆蓋不限于固定在陣列上的探針序列。重復基因組區域,如異染色質或微衛星,通常在陣列上被掩蓋,但可以使用ChIP-seq進行有效分析。
ChIP-seq在樣品數量方面比ChIP芯片更具優勢,因為ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq產生更精確的蛋白質結合位點列表和轉錄因子,增強子和序列基序的鑒定。可以使用ChIP-seq分析染色質和組蛋白變體的核小體定位和翻譯后修飾。這種分析尤其受益于增強的空間分辨率。

ChIP-seq的局限性

ChIP-seq的主要限制是訪問和成本。研究人員可以通過開發自己的構建庫的協議來降低成本,但總體價格必須進一步降低,以與其他方法相媲美。ChIP芯片技術每個陣列的成本約為400-800美元,而ChIP-seq的成本為每通道1,000-2,000美元(對于一個這樣的下一代平臺)。
因為ChIP-seq在免疫沉淀中使用抗體,所以數據的質量依賴于抗體的質量。幾種市售抗體的質量差異很大,不僅在供應商之間,而且在批次之間。可以驗證抗體質量,但是這樣的過程是費力且耗時的。
需要將ChIP-seq產生的譜中的峰與對照樣品中的相同基因座進行比較,以確定峰的顯著性。這通常在免疫沉淀之前用DNA進行,處理DNA但缺乏抗體,并且使用不具有DNA結合或染色質修飾參與的抗體(例如IgG)。這使科學家能夠克服可能已經引入的各種偽影,但目前尚未就哪種控制最合適達成共識,這三種方法的一致性可能不同。

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