Stella（也稱為PGC7或Dppa3）被認為是原始生殖細胞（PGC）中高度表達的蛋白。在整個卵母細胞成熟過程中，Stella會維持其表達并持續(xù)進入到植入前胚胎。目前已經(jīng)有研究表明了Stella廣泛表達在胚胎發(fā)生和誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）中。然而，Stella對卵母細胞發(fā)育的影響，特別是在細胞和分子水平上，仍然是未知狀態(tài)。為此，來自南京醫(yī)科大的Longsen Han等人通過CRISPR / Cas9系統(tǒng)構(gòu)建產(chǎn)生Stella突變小鼠，用以研究Stella的功能。攜帶純合突變的小鼠可以在敲除153-bp（StellaΔ）后仍然可以存活。作者通過western blot證實了突變小鼠中Stella的成功敲除。盡管排卵具有正常外觀，但StellaΔ雌性在與突變體雄性雜交時是不育的。受精后，StellaΔ胚胎在植入前發(fā)育受損，很少達到胚泡期。這種截短的蛋白在細胞核中不存在，但仍然可以在StellaΔ受精卵的細胞質(zhì)中通過免疫染色檢測到。最近，Shin等人發(fā)現(xiàn)，母體Stella被泛素 - 蛋白酶體系統(tǒng)部分切割，N末端片段會保留在細胞質(zhì)中，參與囊泡運輸。因此，與先前報道的常規(guī)敲除小鼠相比，作者構(gòu)建的突變小鼠模型可以加深對Stella功能的了解。

鑒于Stella調(diào)節(jié)受精卵中的表觀遺傳不對稱性，作者研究了Stella是否也參與卵子發(fā)生過程中DNA甲基化的建立。為了解決這個問題，作者分離了來自StellaΔ和野生型（WT）小鼠的卵母細胞，然后使用亞硫酸氫鹽測序（BS-Seq）方法對這些樣本構(gòu)建甲基化圖譜（圖1a）。作者發(fā)現(xiàn)，在WT卵母細胞中，全DNA甲基化水平為38％。然而，在StellaΔ卵母細胞中，平均甲基化水平顯著增加至約68％（圖1b-c）。在所有檢測的基因組特征中觀察到DNA甲基化的廣泛升高，例如啟動子，非翻譯區(qū)（UTR），CpG島（CGI），內(nèi)含子，外顯子以及主要重復(fù)元件（圖1d-g）。這種模式表明StellaΔ卵母細胞的DNA甲基化變化會影響到整個基因組。為了更好地了解改變的甲基化情況，作者還搜索了WT和StellaΔ卵母細胞之間的差異甲基化區(qū)域（DMR）。總共識別出21,036個DMR，其中20,998個是高甲基化的（高DMRs; 99.8％），只有38個是低甲基化的（低DMRs; 0.2％）（圖1h）。Stella通過結(jié)合UHRF19顯示能夠抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1的募集，這可能是介導(dǎo)Stella對卵母細胞甲基化作用的關(guān)鍵途徑。總之，作者的研究結(jié)果表明，Stella是一種新的必需因子，可防止卵母細胞發(fā)育過程中DNA甲基化過多。

圖1：Stella在卵母細胞和合子發(fā)育過程中控制DNA甲基化的不同作用

為了追蹤Stella對親本基因組DNA甲基化的影響，作者分別分離了晚期受精卵的單個雌性和雄性原核用于全基因組分析（圖1a）。在來自WT小鼠的卵母細胞和受精卵之間的母體DNA的甲基化水平中的變化有限。然而，在StellaΔ小鼠中，母體DNA甲基化組從卵母細胞（68％）到受精卵（55％）發(fā)生了顯著的去甲基化（圖1b-c）。作者發(fā)現(xiàn)StellaΔ受精卵的雌性原核中5hmC信號顯著增加；而WT受精卵中的雌性原核表現(xiàn)出強度低得多的5hmC染色（圖1i-j）。這些結(jié)果均表明在StellaΔ合子發(fā)育過程中母體基因組發(fā)生去甲基化。TET3是一種關(guān)鍵的雙加氧酶，可催化父系基因組中5mC至5hmC的轉(zhuǎn)化，而Stella可阻斷TET3活性以維持母體DNA的甲基化水平。 StellaΔ受精卵中母體基因組的重度去甲基化可能是由于TET3獲得了女性原核細胞。接下來，為了尋找哪些甲基化是被Stella保護的潛在基因座和基因，作者分別分析了來自WT和StellaΔ小鼠的卵母細胞和母體原核之間20kb窗口的DNA甲基化水平的差異。總共鑒定了6388個基因組基因座和2203個基因（圖1k-l），例如發(fā)育相關(guān)基因Csmd1（圖1m），Zdhhc6和Erbb4。GO分析進一步表明這些基因富含在神經(jīng)系統(tǒng)和代謝過程中起重要作用的途徑中。與WT受精卵相比，StellaΔ受精卵中父本基因組的平均甲基化水平顯著增加，盡管程度并不顯著（圖1b-c）。作者的研究結(jié)果表明Stella參與了小鼠合子發(fā)育過程中母體基因組的DNA甲基化維持。

另一方面，作者注意到，盡管已發(fā)生DNA去甲基化，但與WT受精卵相比，StellaΔ受精卵中雌性原核的平均甲基化水平仍然升高（圖1b-c）。這一觀察結(jié)果促使作者提出StellaΔ受精卵中如此高水平的母體DNA甲基化可能起源于卵母細胞中的全基因組高甲基化。為了檢測這種可能性，作者評估了不同基因組特征對StellaΔ卵母細胞和受精卵中DNA高甲基化的貢獻。在StellaΔ卵母細胞的所有元件中檢測到甲基化的增加，其中最大比例由基因間區(qū)域貢獻（48％）。與其對應(yīng)WT細胞相比，StellaΔ受精卵的母體基因組顯示出相似的模式。WT或StellaΔ小鼠中卵母細胞和雌性原核之間不同元素的去甲基化程度幾乎相同。當保護母體DNA免受受精卵中的去甲基化時，Stella對特定基因組區(qū)域沒有偏好。此外，作者發(fā)現(xiàn)在StellaΔ受精卵的母體基因組中發(fā)現(xiàn)的91％具有高DMR（621/680）的基因確實是從它們的卵母細胞遺傳的。總之，這些數(shù)據(jù)表明StellaΔ小鼠中卵母細胞甲基化組的全基因組高甲基化導(dǎo)致雌性原核中的DNA甲基化水平高于WT小鼠。考慮到BS-Seq檢測的是5mC和5hmC的總和，并且在StellaΔ雌性前核中可檢測到強的5hmC信號，在StellaΔ小鼠中從卵母細胞向受精卵轉(zhuǎn)變期間可能發(fā)生更顯著的DNA去甲基化。

總之，通過構(gòu)建Stella突變小鼠模型，作者將Stella鑒定為在卵子發(fā)生過程中防止過量DNA甲基化所必需的新因子。受精后，Stella參與了合子發(fā)育過程中母體基因組甲基化的維持。作者還提供了來自StellaΔ小鼠的卵母細胞和受精卵中DNA甲基化景觀的全基因組范圍的綜合圖譜，其為表觀遺傳控制中的Stella功能提供了新的認知。