隨著手術、化療、放療、內分泌治療、靶向治療及免疫治療等多種治療方式的綜合應用，癌癥病人的生存期明顯延長，如何進一步提高癌癥病人的生存質量仍面臨著巨大挑戰。

循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為一種潛在的腫瘤標記物，其檢測低創傷性、可重復性，能為癌癥病人的早期診斷、腫瘤負荷監測、藥物療效預測、復發轉移及預后評估提供有效信息。

循環腫瘤DNA（ctDNA）概述

1948年，Mandel和Métais首次在人類血漿中檢測出細胞外循環游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。腫瘤病人體內存在的cfDNA，是由腫瘤細胞、炎性細胞等異常或正常細胞釋放到血管中的游離DNA片段組成的。

cfDNA中，攜帶腫瘤特有突變的小部分DNA片段稱為循環腫瘤DNA，其來源于腫瘤細胞并通過凋亡、壞死或直接分泌的方式釋放進入循環系統。ctDNA的清除可能與肝臟和腎臟代謝有關，由于DNA片段大小、結構等不同，其半衰期從數分鐘到數小時不等。

循環腫瘤DNA（ctDNA）的檢測方法

ctDNA檢測也稱作“液態活檢”，其能全面的反映與腫瘤組織相同的突變基因組信息，包括點突變、基因擴增、拷貝數異常、過度甲基化等。其中TP53（tumor protein p53）、PIK3CA（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit alpha）和GATA3（GATA binding protein 3）三種基因突變的檢出率較高。

目前，ctDNA的檢測方法主要有數字聚合酶鏈式反應（dPCR）和二代測序（NGS）。

（一）數字聚合酶鏈式反應

dPCR是一種核酸分子絕對定量檢測技術，即將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成上萬個和數百萬個PCR反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，通過讀取熒光信號的有或無進行計數，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量。

但是，dPCR只能分析評估單一的數量有限的堿基對改變，通量相對較低，僅用于對已知的特定基因進行定量檢測。在dPCR的基礎上，microfluidic PCR、ddPCR及BEAMing（bead emulsion amplification magnetic）等技術的進步提高了ctDNA檢測的靈敏度。

（二）二代測序

NGS技術的發展實現了對全部基因或某些指定區域進行測序，提高了測序速度，降低了測序成本，并能發現未知突變序列，從而獲取更多腫瘤遺傳信息。目前，安全測序系統（safe-sequencing system，Safe-SeqS）和雙向測序（duplex sequencing）可提高NGS檢測ctDNA的靈敏度及特異度。

安全測序系統為目標基因增加一個稱為UID（unique identifier）的特定編碼的序列，然后進行擴增，增加目標基因的濃度，即可有效提高后續測序的靈敏度。雙向測序類似于安全測序系統，不同在于最終擴增的是目標基因的雙鏈并同時測序，以顯示目標基因的真實突變。有研究表明，在cfDNA足量時，NGS的靈敏度（0.02%~5.00%）取決于測序深度。測序深度越高，相對應的靈敏度及特異度越高，得到的數據信息量也越大，同時時間及成本也會增加，應根據研究及應用需要合理選擇。

擴增子測序屬于NGS技術，其原理是邊合成邊測序。用不同顏色的熒光標記4種脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP），當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同熒光，根據計算機軟件來處理捕捉到的熒光信號，可以獲得待測的DNA序列信息。針對多種DNA，通過多重PCR技術，把ctDNA攜帶的特殊基因突變區段擴增出來，進行高通量測序和分析。

腫瘤個性化分析深度測序（CAPP-Seq）是新的NGS技術，CAPP-Seq基于捕獲技術的進步，可以用于特定腫瘤類型的大部分病人，并可以探測幾乎所有主要類型的突變。在測序前通過雜交靶向基因成反義寡核苷酸來豐富基因組，從而增加了檢測的敏感度，能有效分析不同病人的ctDNA。

目前，ctDNA檢測方法及結果處理缺乏統一的標準，仍不能廣泛應用于臨床，但二代測序檢測相關指南的出臺即將改觀此現象。