果子碎碎念

這篇帖子應(yīng)該是昨天發(fā)的，但是高師姐一不小心發(fā)給了別人，我也不好意思打擾她，結(jié)果到今天早上她才知道，所以今天補(bǔ)發(fā)。
高師姐在今天的正文前，講了一大段對(duì)于自己實(shí)驗(yàn)思考的話(huà)，我覺(jué)得很有意思，如果我們僅僅講技術(shù)，那還不如直接去網(wǎng)上檢索protocol來(lái)得直接。
以下是高師姐的正文

高師姐的絮叨

昨天預(yù)答辯順利結(jié)束，總的來(lái)說(shuō)，還不錯(cuò)。預(yù)答辯時(shí)遇見(jiàn)一個(gè)比較懂的老師，提了幾點(diǎn)很好的建議，當(dāng)有些建議不謀而合后，內(nèi)心還是有些小確喜的。證明我們關(guān)注的東西是一樣的。其中就提到說(shuō)我在用抑制劑后，檢測(cè)蛋白的相互作用全用WB顯示，而沒(méi)有Co-IP的圖片。哎，說(shuō)起這個(gè)就是痛啊，因?yàn)閮?nèi)源性的蛋白相互作用真的是不好做啊。就像果子老師昨天說(shuō)的，做多了后，才發(fā)現(xiàn)都是坑。下面跟大家先分享哈這個(gè)小故事。

我的實(shí)驗(yàn)中三個(gè)蛋白的相互作用是功能性的相互作用，結(jié)合的時(shí)間不長(zhǎng)，并且弱，本身就比較難檢測(cè)到。加上在使用抑制劑后，他們不會(huì)有相互作用。我做了至少5次，發(fā)現(xiàn)在加了抑制劑后是沒(méi)有相互作用的。做到這里，大部分的人都會(huì)喜大普奔，很開(kāi)心的下結(jié)論，說(shuō)它們沒(méi)有相互作用了，證實(shí)抑制劑就是抑制它們的相互作用。

但是，但是哈，大家有沒(méi)有想過(guò)，這是實(shí)驗(yàn)技術(shù)本身的問(wèn)題，因?yàn)椴豢赡苡幸粋€(gè)抑制劑能100%抑制住，能達(dá)到50%或者70%都是非常牛逼了的。那問(wèn)題來(lái)了，就算剩下的相互作用再弱，你也應(yīng)該檢測(cè)的到一些些吧。所以最好的狀態(tài)就是可以檢測(cè)到下降的趨勢(shì)，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這樣比較讓Reviewer信服。

我當(dāng)然不會(huì)告訴你們我也會(huì)考慮到這些，那肯定有人會(huì)問(wèn)那你怎么不增加蛋白的量呢？你們不會(huì)知道我做不加抑制劑時(shí)的相互作用，培養(yǎng)了多少細(xì)胞。10瓶T175，有沒(méi)有，有沒(méi)有，當(dāng)時(shí)收蛋白直接手軟到懷疑人生。input都達(dá)到了10 mg，真的是極限了。即使這樣，我用同樣的方法做了三組抑制劑的Co-IP，重復(fù)了5次，用了超敏的ECL顯影劑，用了P32放射性同位素標(biāo)記，依然只做出了其中兩組，另外有一組死活都做不出來(lái)，心好累啊。

那外源性的Co-IP呢？這也有問(wèn)題。外源性是同時(shí)轉(zhuǎn)了3個(gè)質(zhì)粒，病毒感染后，使用抑制劑，在內(nèi)源性的同一時(shí)間檢測(cè)三個(gè)蛋白的相互作用，這個(gè)還是比較好做的。但是，你最后的結(jié)果跟你的轉(zhuǎn)染效率非常相關(guān)，3個(gè)質(zhì)粒單獨(dú)的轉(zhuǎn)染效率要差不多一樣。說(shuō)句實(shí)話(huà)，不知道大家有沒(méi)有遇到，原本你已經(jīng)把三個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率調(diào)得差不多一致了，但是三個(gè)一起轉(zhuǎn)了后，就會(huì)變得不一樣。所以我的外源性的Co-IP雖然趨勢(shì)都一致吧，但是有時(shí)候強(qiáng)，有時(shí)候弱。不知道在看這篇文章的你們，有沒(méi)有什么好的建議啊。大家可以一起分享。

最后，肯定會(huì)問(wèn)，那怎么不用免疫熒光的方法檢測(cè)三者的相互作用呢？我的情況是這樣的，其中一個(gè)蛋白在正常的細(xì)胞中表達(dá)就很少，還主要在胞核中存在，而相互作用的場(chǎng)所在胞漿。一般不刺激是無(wú)法用免疫熒光的方法檢測(cè)到的。而外源性轉(zhuǎn)入一個(gè)帶GFP或者mCherry的質(zhì)粒，在三個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入時(shí)，細(xì)胞能量消耗太多，容易死亡。
(果子插一句：看到?jīng)]，其實(shí)很多時(shí)候我們考慮了很多事情，但是往往提問(wèn)者卻以為抓到了把柄)
在這里，絮絮叨叨說(shuō)了這么多，是因?yàn)轭A(yù)答辯的時(shí)候，我準(zhǔn)備回答和請(qǐng)教給我提問(wèn)的那個(gè)老師，但是由于時(shí)間不夠，沒(méi)有搞成，所以今天在這里說(shuō)了那么多。

好了，今天準(zhǔn)備跟大家分享CCK-8的相關(guān)內(nèi)容，大概分四-五次分享。今天主要分享CCK-8的原理，用途及常用的公司試劑盒。

CCK-8是什么

在做每個(gè)東西之前，都要搞清楚這個(gè)東西是什么。CCK-8的英文全稱(chēng)是Cell Counting Kit-8，也就是進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的一個(gè)盒子。那它的用途也就大致可以猜到，和細(xì)胞增殖相關(guān)的實(shí)驗(yàn)都可以。

CCK-8的原理

在CCK-8試劑盒中，最主要的化學(xué)藥品是WST-8，化學(xué)名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽。它的核心基團(tuán)和MTT是一樣的，是MTT的升級(jí)版本。在電子耦合試劑（也就是細(xì)胞是活的，有呼吸，有能量代謝）存在的情況下，可被NAD+氧化還原成為水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan)。活細(xì)胞越多，產(chǎn)生的Formazan就越多，顏色也會(huì)越深（如圖1，來(lái)自于Sigma）。
所以粗略的可以認(rèn)為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。為什么是粗略的呢，因?yàn)檫@里沒(méi)有考慮到細(xì)胞代謝水平的高低，有些細(xì)胞在藥物處理后，可能活細(xì)胞數(shù)不變，但是代謝率低了以后，細(xì)胞呼吸減弱，NAD+產(chǎn)生減少，測(cè)出的Formazan也會(huì)減少，所以此時(shí)怎么算呢（此時(shí)我就比較懷戀中性紅了）？當(dāng)然也有解決的辦法，下期給大家介紹。因此可利用這個(gè)原理進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，在吸光度為450時(shí)檢測(cè)讀數(shù)。

CCK-8的用途

1.細(xì)胞增殖測(cè)定：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在很多領(lǐng)域都會(huì)用到，比如腫瘤相關(guān)、損傷后修復(fù)等。
2.藥物篩選：在測(cè)定一個(gè)藥物的毒性和安全有效濃度時(shí)，經(jīng)常會(huì)用到CCK-8。
3.細(xì)胞毒性測(cè)定：這個(gè)可以和各個(gè)處理因素對(duì)細(xì)胞活性和增殖的影響，比如在UV、低氧或者什么化學(xué)物品對(duì)細(xì)胞的影響上。
4.腫瘤藥敏試驗(yàn)：這個(gè)是用的比較廣的，我見(jiàn)過(guò)做腫瘤的團(tuán)隊(duì)，買(mǎi)CCK-8都是一整箱，一整箱的買(mǎi)，比如果子老師所在的團(tuán)隊(duì)，哈哈哈。
5.微生物對(duì)細(xì)胞的毒性或增殖的實(shí)驗(yàn)。

CCK-8盒子的選購(gòu)

還記得第一次做CCK-8的實(shí)驗(yàn)時(shí)研究生二年級(jí)的時(shí)候，當(dāng)時(shí)用的第一個(gè)盒子是Sigma的，當(dāng)時(shí)的Sigma-Aldrich就是Sigma-Aldrich，還不是現(xiàn)在的Millipore-Sigma。那個(gè)盒子給了我莫大的鼓勵(lì)，因?yàn)樵谀侵白龇肿涌寺∫恢倍疾皇呛茼樌＿@個(gè)盒子是我的碩士老板從美國(guó)帶回來(lái)的，品質(zhì)有保證，最后的結(jié)果也是很好的。后面在做CCK-8的實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們?cè)谟羞x擇的情況下都會(huì)買(mǎi)sigma，下圖2是sigma官網(wǎng)的截圖。其實(shí)也不貴，只是到貨時(shí)間太慢。