遺傳密碼除了ATCG四堿基之外，其中胞嘧啶C也因其嘧啶環第5倍碳原子的甲基化修飾，而攜帶表觀遺傳信息而被稱為第5位堿基（5-甲基胞嘧啶，5mC）。DNA的甲基化修飾自1948年被發現以來，一直都是表觀遺傳領域的研究熱點[1]。DNA的甲基化修飾賦予了DNA雙鏈除蛋白質編碼信息外的表觀遺傳記憶，對基因組穩定性、基因表達和發育具有深遠的影響。[2] PMID: 24439369：Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. 胞嘧啶的甲基化修飾的酶促機制人們早已清楚，包括從頭進行甲基化修飾的甲基轉移酶DNMT3A等以及維持DNA甲基化的DNMT1等[3]。其中DNMT3A和DNMT3B 建立新的DNA甲基化模式，它們的活性可以由無催化活性的DNMT3L調節。DNMT1的功能是維持新合成鏈中的胞嘧啶甲基化修飾，基因組中的回文結構CpG二核苷酸正是DNMT1作用的基礎，所以在基因組中兩條鏈互補的CpG胞嘧啶通常以對稱方式甲基化。除了CpG胞嘧啶的修飾外，非CpG（CpH，H = A，T，C）的甲基化在植物常見，也發現于哺乳動物的卵母細胞、多能胚胎干細胞（ESCs）和成熟神經元中（其他體細胞中雖然很少見但也有分布）[4-6]。

圖 1. DNA甲基轉移酶種類與結構

很長一段時間以來，人們對DNA去甲基化的認識還是停留在被動去甲基化（passive demethylation）途徑：即在DNA合成的過程中，新合成的那條鏈是無甲基化修飾的，如果DNMT1不能很好的依照舊DNA鏈的甲基化模板，維持新鏈DNA甲基化修飾的話，那么新合成的DNA則失去了甲基化修飾。[7]

圖 2. 哺乳動物中的DNA甲基化的從頭甲基化酶以及被動去甲基化過程示意圖。Dnmt3a和Dnmt3b可將甲基引入未甲基化的DNA中。當DNA被復制時，舊鏈上的甲基被識別，并通過酶Dnmt1在新鏈上引入新的甲基。去甲基化可以在Dnmt1失活的情況下發生，經過多次DNA復制達到被動去甲基化的結果。

被動去甲基化的原理很簡單，但并不能解釋一些生命過程，如配子發育及早期胚胎發育過程中的甲基化重塑過程。例如在受精后，受精后，母本來源基因組中的5mC主要通過被動去甲基化而喪失，而父系基因組中的5mC在數小時內迅速喪失，這表明存在全局的主動去甲基化過程[8, 9]。

圖 3 a.生殖細胞發育及胚胎發育過程中的去甲基化與重編程（reprograming）示意圖。b. 胚胎發育早期甲基化程度動態變化真實結果。c. 各去甲基化酶以及甲基化酶在胚胎發育早期的動態表達趨勢。

對于DNA的主動去甲基化的了解，直到2009年DNA的去甲基化酶--DNA雙加氧酶TET的發現，才標志著DNA主動去甲基化研究的真正開始[10]。DNA甲基化修飾的主動去除大體上分為氧化途徑與非氧化途徑，篇幅所限不再贅述，感興趣可詳閱Cell雜志的一篇經典綜述[2]。在多種去甲基化途徑中有兩個關鍵分子：DNA雙加氧酶--TET（ten-eleven translocation）以及胞嘧啶脫氨酶--APOBEC。其中TET可催化5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化，生成的第一步氧化產物也就是我們這一系列專題的主角--5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine ,5-hmC)。TET蛋白還可進一步氧化5- 羥甲基胞嘧啶為5- 甲酰胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶 (5-carboxylcytosine,5caC)， 5fC和5caC可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）特異性識別并切除，從而實現DNA的主動去甲基化。除氧化途徑外，APOBEC1或AID酶對5hmC至5hmU的脫氨作用，隨后進行堿基切除修復（BER）修復，這是在腦和原始生殖細胞中潛在的主動去甲基化途徑[2]。TET酶與APOBEC酶不但在DNA的去甲基化過程中發揮關鍵作用，同時也被利用為甲基化研究的工具酶，將在后續部分中詳述。

圖 4. 被動及主動去甲基化的過程示意圖

如圖4中可見，5甲基化胞嘧啶的氧化過程中產生了5hmC以及更進一步的氧化產物。一個重要的問題是這些5mC的氧化衍生物是否僅僅是去甲基化過程的中間產物，或者它們本身是否具有功能作用。全基因組測序的方法已經生成5hmC堿基修飾在基因組中的分布[11, 12]。這5hmC的修飾水平顯著低于5mC水平：5hmC的水平在不同組織間的比例約在0.05%~0.6%，大多在0.1%左右，而5mC修飾比例約為2.5~3%。5hmC的含量變化不但與細胞類型有關，還與基因組的不同結構有關，在P300及CTCF結合位點，以及增強子與DNase I超敏位點等調控區域中含量最高。這也提示了5hmC并不僅僅是胞嘧啶去甲基化的中間體，而具有特定的功能。

圖 5. 5hmC在不同組織、細胞以及不同結構區域中的含量

在人體的各種組織中，大腦的5hmC含量最高，在成年大腦中，13％的所有CpG都是高度羥甲基化的，在基因區和遠端調節元件中具有強烈富集。在發育過程中，5hmC的比例在前額葉皮質中發生了很大的改變，在成年個體中檢測到大約2840萬hmCs，比胎兒前額葉皮層高10倍。hmC主要存在于CpG中（成人為97.4％）皮質和胎兒皮質中的99.86％）[13]

圖 6. 人腦中的5hmC和5mC分布示意圖。（a） CG，CHH和CHG序列中成人或胎兒腦中hmCs或有修飾的胞嘧啶的百分比。（b） hmC，mC和總修飾（hmC + mC）譜的實例。[13]

絢爛多彩生命現象背后是復雜表觀遺傳調控機制，隨著剝繭抽絲般的研究一步步深入，神秘而奧妙的生命遺傳本質的面紗正逐步被揭開。最初啟動子區的甲基化修飾被廣泛地接受為抑制性表觀遺傳學修飾，后來更新報道提示了基因本體（gene body）區域甲基化修飾的轉錄激活作用[14]，除此之外，甲基化對基因表達的調控可能還涉及5mC和序列特異性的轉錄因子（TF）之間的相互作用[15, 16]。

DNA甲基化也曾被認為是一種穩定的可遺傳的標記，而后續又發現在正常的發育、分化以及疾病的發生發展中，甲基化在增強子、gene body以及一些調控元件上會發生動態的變化，提示了甲基化修飾在這些過程中的調控作用[6, 17]。例如，在正常的發育過程中全基因組的甲基化水平會出現整體的去甲基化；在生殖細胞著床后的全局甲基化水平增加；在胎兒發育的晚期的調節序列的局部去甲基化；在分化組織中活躍調節序列中的去甲基化；在衰老以及腫瘤的發展過程中也會普遍存在DNA甲基化的變異[18]。

圖 7. 正常的發育階段中的整體甲基化水平變化；以及發育、衰老以及腫瘤過程中特定區域的DNA甲基化變化示意圖。

5hmC，5-fC和5-CaC的發現將會為帶來了更深入的認識。對于DNA甲基化的研究要用動態的眼光去考察，分析mC與5hmC修飾是如何在正確的時間修飾在正確的地點。此外甲基化修飾并不是孤立的存在，而是與各種相關蛋白或轉錄因子共同作用發揮功能，所以在研究DNA甲基化修飾的同時，整合的分析組蛋白修飾的變化以及TET、DNMT與MECP2等甲基化相關蛋白的表達與結合位點變化，將幫助我們更全面的認識DNA甲基化修飾這一復雜的表觀遺傳調控機制。

圖 8. DNA甲基化在不同基因組結構中的功能和調控模式示意圖

后續我們重點關注5hmC的功能以及分析技術的進展和相關研究的應用案例，敬請期待。

圖 9

1. Hotchkiss, R.D., The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. J Biol Chem, 1948. 175(1): p. 315-32.

2. Wu, H. and Y. Zhang, Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell, 2014. 156(1-2): p. 45-68.

3. Bestor, T.H., The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet, 2000. 9(16): p. 2395-402.

4. Xie, W., et al., Base-resolution analyses of sequence and parent-of-origin dependent DNA methylation in the mouse genome. Cell, 2012. 148(4): p. 816-31.

5. Lister, R., et al., Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science, 2013. 341(6146): p. 1237905.

6. Schultz, M.D., et al., Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature, 2015. 523(7559): p. 212-6.

7. Reik, W. and J. Walter, Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat Rev Genet, 2001. 2(1): p. 21-32.

8. Reik, W., W. Dean, and J. Walter, Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science, 2001. 293(5532): p. 1089-93.

9. Zhu, P., et al., Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. Nat Genet, 2017. 50(1): p. 12-19.

10. Tahiliani, M., et al., Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science, 2009. 324(5929): p. 930-5.

11. Ito, S., et al., Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science, 2011. 333(6047): p. 1300-3.

12. Bachman, M., et al., 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem, 2014. 6(12): p. 1049-55.

13. Wen, L., et al., Whole-genome analysis of 5-hydroxymethylcytosine and 5-methylcytosine at base resolution in the human brain. Genome Biol, 2014. 15(3): p. R49.

14. Yang, X., et al., Gene body methylation can alter gene expression and is a therapeutic target in cancer. Cancer Cell, 2014. 26(4): p. 577-90.

15. Domcke, S., et al., Competition between DNA methylation and transcription factors determines binding of NRF1. Nature, 2015. 528(7583): p. 575-9.

16. Stadler, M.B., et al., DNA-binding factors shape the mouse methylome at distal regulatory regions. Nature, 2011. 480(7378): p. 490-5.

17. Lister, R., et al., Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature, 2009. 462(7271): p. 315-22.

18. Luo, C., P. Hajkova, and J.R. Ecker, Dynamic DNA methylation: In the right place at the right time. Science, 2018. 361(6409): p. 1336-1340.