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學的理論知識終于要派上用場了，可開學 2 周了還是一頭霧水，我的實驗該從哪里入手呢  小師妹，別擔心，師兄我已在實驗室摸爬滾打多年，包你分分鐘學會  那真的太感謝師兄了  學習了師兄的實驗方法后，奇怪，為什么我還是做不出滿意的結果呢  實驗方法太多了，每個人做實驗的習慣方式千差萬別，其實你只需要學習一套標準的實驗流程就 ok 了 哪里有？快講 莫急，下面針對最常見的 ELISA/WB/IHC 三大實驗，我給你做一個詳細的講解吧 免疫組化、Western、ELISA，是免疫學三大常用工具，分別用于定位，定性和定量。博士君在歷經 26 年的刻苦專研，一路從實驗小白變身為實驗達人，特別能理解初入門的學員，為了幫助初學者快速上手，減少摸索的苦惱，博士君特地趕在開學季前為大家精心準備了實驗視頻以及實驗操作要點等，有了這篇干貨，相信大家就能輕松搞定實驗當中的疑難雜癥。文檔都準備好了，快點擊文末「閱讀原文」一鍵下載收藏！
先要進行 SDS-PAGE，然后將分離開的蛋白質樣品用電轉儀轉移到固相載體上，而后利用抗原 - 抗體 - 標記物顯色來檢測樣品，可以用于定性和半定量。
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原因 | 解決辦法 | 抗體濃度太高 | 優(yōu)化/降低一抗和二抗的濃度 | 抗體孵育溫度過高 | 4 ℃ 孵育 | 二抗非特異性結合或與封閉劑交叉反應 | 設置二抗對照（不加一抗），降低二抗?jié)舛?/p> | 一抗或二抗與封閉劑有交叉反應 | 在孵育和洗滌液中加入 Tween-20 減少交叉反應. | 封閉不充分 | 延長封閉時間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | 抗體與其它蛋白質交叉反應 | 更換不同的封閉液；勿在含生物素體系中使用脫脂奶粉封閉；降低二抗?jié)舛龋粰z測二抗與膜的交叉反應性 | 洗膜不充分 | 增加洗滌次數(shù) | 膜干燥 | 保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象 |
原因 | 解決辦法 | 抗體 | 增加抗體濃度；抗體與抗原結合差；抗體喪失活性 | 抗原不足 | 增加上樣量 | 抗原被封閉液遮蔽 | 試用不同的封閉液 ；優(yōu)化封閉液中蛋白質濃度 ；縮短封閉時間 | 蛋白質樣品在儲存過程中降解 | 重新制備樣品 | 轉膜不充分,或洗膜過度 | 使用麗春紅檢測轉膜效果，PVDF 膜需浸透,需正確的轉膜操作，勿過度洗膜 | 過度封閉 | 使用含 0.5% 脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液,或更換封閉劑，減少封閉時間 | 一抗失效 | 使用有效期內抗體,分裝保存,避免反復凍融取用, 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用 | 酶和底物失效 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物,使用新鮮的底物 |
原因 | 解決辦法 | 一抗?jié)舛冗^高 | 在滿足一定的敏感性的情況下，降低一抗?jié)舛?/p> | 二抗引起的非特異條帶 | 免疫球蛋白是一個超家族，而標本中含有大量的類似球蛋白的抗原，容易和二抗引起反應，尤其是在變性的情況下，在滿足敏感性要求的前提下，熒光標記一抗，酶標兔抗熒光就可以解決這個問題 | 蛋白的降解 | 同前 | 上樣量過高 | 適當減少上樣量 | 洗滌不完全 | 可適當延長洗滌時間 | 封閉不好 | 延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液 |
原因 | 解決辦法 | 抗體濃度太高 | 降低抗體濃度 | 蛋白質上樣量太多 | 降低蛋白質上樣量 | 遷移過快、電泳溫度過高 | 降低電泳速度，低溫電泳（冷室） |
用到了免疫學原理和化學反應顯色，需要將抗原或抗體結合到固相載體表面，從而使后來形成的抗原 - 抗體 - 酶 - 底物復合物粘附在載體上，這就是 「吸附」的含義。
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每個標本量收集體積 ＝100 μL × 檢測種類，如要做復孔，標本量收集體積 ＝對收集后當天進行檢測的標本，儲存在 4 ℃ 備用，如有特殊原因需要周期收集標本，將標本及時分裝后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 條件下保存，避免反復凍融。標本 2~8 ℃ 可保存 48 小時，-20 ℃ 可保存 1 個月。-70 ℃ 可保存 6 個月。部分激素類標本需添加抑肽酶。如需離心的樣本，離心轉速不宜過高（2000~3000 rpm）。加完樣本稀釋液溶解標準品后應混勻放置室溫 10~15 min 后再開始梯度稀釋標準品。生物素標記的抗體需用抗體稀釋液按 1:100 配制，在加入 96 孔板前 2 小時內準備，37 ℃ 恒溫孵育，避免溫度變化過大。* 手洗容易導致吸附在酶標板底部的試劑脫落，從而導致結果偏小，手洗次數(shù)過多也會影響實驗結果，建議機洗。ABC 在加入酶標板前 1 個小時內用 ABC 稀釋液按 1:100 配制，使用前應放至室溫平衡 30 min。TMB 在使用前應放置室溫平衡 30 min，加的量為 90 μL。加完 TMB 終止液應讓其混勻再在酶標儀上讀數(shù)使用 CurveExpert 軟件擬合標準曲線，根據(jù)標準曲線的擬合度（r 或 R2）以及殘差平方和（s）選擇合適的曲線。我們的大多數(shù) ELISA 試劑盒均適用于血清，血漿，細胞培養(yǎng)上清液和其它體液。在產品說明書和我們的目錄上您會看到具體的適用范圍。1）在一些測試中，樣本的讀數(shù)高于標準曲線，為了得到更加準確的結果，需使分析物的含量在測定范圍內，因此需要稀釋；2）以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體反應充分體現(xiàn)出來。原因 | 解決辦法 | 不正確的洗滌：洗滌不充分或省略洗滌步驟中的任何一步均會導致背景色過高 | 檢查洗滌緩沖液的體積并確保完成所有的洗滌步驟；確保洗滌緩沖液的正確稀釋和正確使用 | 底物污染：在實驗時留存一些額外的底物，底物本身不應該有顏色 | 確保在使用前，底物不被金屬離子或氧化劑污染 | 底物曝光：底物曝光會使底物變成藍色 | 在加入板內之前要保存在暗處（即試劑瓶內） | 偶合物的錯誤稀釋 | 偶合物濃度過高會造成高背景色，因此要嚴格按照產品說明書稀釋 | 孵育時間和溫度不對 | 必須嚴格按照產品說明書來確定孵育時間和溫度 |
4. 梯度稀釋時出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象主要有哪些原因？ 原因 | 解決辦法 | 酶標板疊放 | 避免酶標板疊放 | 梯度稀釋時不準確 | 確定移液槍精準，梯度稀釋正確 | 蒸發(fā) | 封閉時加封板膜或蓋板 | 酶標板底部有雜物或水珠 | 加試劑時確保酶標板底部干凈 |
融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色，來對組織（細胞）內抗原進行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。
1. 組織取材 為避免蛋白丟失及組織受損引起的非特異試劑吸附，取材須快速（組織塊也不宜太大）且要盡量避免人為損傷。
2. 固定 固定要及時、徹底，但也不能固定過久。實驗證明甲醛固定時間越久的組織越容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。一般以 12~36 小時最好。 3. 石蠟片與冰凍片的選擇 石蠟片制作對設備要求較冰凍片低，組織結構更好，保存條件簡單時間也久。但對部分蛋白有較強烈的破壞作用，對蛋白保護較冰凍片差。冰凍片對蛋白的保護較石蠟片好，制作起來也較快。 4. 滅活 過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)的一定要做內源性過氧化物酶的滅活，而對于堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)和免疫熒光這個步驟不需要做。 5. 抗原修復 不同的樣本、不同的蛋白其最佳的抗原修復方式會有所區(qū)別，熱修復（酸性修復液（檸檬酸鹽修復液）、堿性修復液（EDTA 修復液）及酶修復（蛋白酶）都可做嘗試。對于陳舊的樣本要增加修復強度，比如延長修復時間。 6. 封閉 常用的封閉液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封閉液。血清應選擇與二抗同源的血清。 7. 抗體孵育 一抗一定要與實驗及樣本匹配的，孵育條件以 4 ℃ 過夜最佳。二抗應匹配一抗，37 ℃ 孵育半小時即可。 8. 顯色 DAB 顯色建議在鏡下控制反應時間，在陽性及背景之間選擇平衡點。 9. 結果觀察 建議在數(shù)據(jù)庫中查詢準確的表達部位，比如： https://www./ https://www./ 原因 | 解決辦法 | 一抗和二抗不匹配 | 使用針對一抗的二抗（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體） | 沒有足夠的一抗與目標蛋白結合 | 提高一抗用量。延長 4 ℃ 孵育時間（如過夜） | 由于不當儲存、稀釋或反復凍融造成一抗/二抗試劑盒失效 | 做陽性對照確認一抗/二抗試劑盒的有效性 | 樣本中沒有目標蛋白 | 建議做陽性對照 | 目標蛋白含量太少 | 應用信號放大操作 | 脫蠟不徹底 | 延長脫蠟時間，更換二甲苯 | 固定液封閉了抗體識別表位 | 縮短固定時間，加強抗原修復 | 蛋白位于細胞核內（核蛋白），抗體不能穿透核膜 | 對樣本進行破膜通透處理 | PBS 緩沖液被細菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根 | 在抗體 PBS 儲存液中加入適量防腐劑，或使用新鮮無菌的 PBS |
原因 | 解決辦法 | 封閉不充分 | 選擇合適的封閉液，延長封閉時間 | 一抗?jié)舛冗^高 | 針對一抗做濃度梯度實驗，選擇合適濃度 | 孵育溫度過高，時間過長 | 選擇 4 ℃ 過夜或縮短孵育時間 | 二抗質量不佳 | 不加一抗，做二抗對照，選擇合格二抗 | 組織沖洗不徹底 | 加強洗滌 | 內源性過氧化物酶含量過高 | 延長 3%H2O2滅活時間或用 0.5% 高碘酸溶液室溫孵育 10 min | 固定過度 | 改變抗原修復方法或減小抗原修復強度。 | 信號過度放大 | 縮短抗體孵育時間 | 通透作用破壞膜并除去了膜蛋白 | 去除緩沖液中的通透劑 | 顯色底物過量或顯色時間太長 | 縮短底物孵育時間 |
原因 | 解決辦法 | 一抗/二抗?jié)舛冗^高 | 降低抗體濃度和或縮短孵育時間 | 存在內源性過氧化物酶活性 | 延長 3%H2O2 滅活時間或用 0.5% 高碘酸溶液室溫孵育 10 min | 一抗與被染組織同源（如用鼠一抗檢測鼠組織），加二抗后，二抗會與同源的所有組織結合 | 應用與組織非同源的一抗 | 切片/細胞變干 | 保持切片/細胞濕度，切勿變干。 |
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