RNA-seq測序方法

1. 在測mRNA過程中，首先要去除rRNA。以人為例，在抽提的總RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的則是lncRNA、microRNA、siRNA等。

2. rRNA整個人類當(dāng)中是非常保守的，在各個組織器官中也是非常穩(wěn)定的，因此這些測序結(jié)果對我們的研究是沒有用處的。mRNA則是RNA中比較重要的部分。

3. Illumina公司的Truseq RNA建庫方法是應(yīng)用最廣泛的一種，真核普通轉(zhuǎn)錄組為例：

• 首先以mRNA的Poly(A)(高等生物特有的)這個特點，讓帶有Poly(T)探針的磁珠與總RNA進行雜交，使mRNA和磁珠相結(jié)合在一起。

• 接著回收磁珠，將帶有Poly(A)的mRNA從磁珠上洗脫下來。

• 然后用鎂離子溶液將洗脫下來的mRNA打成片段，被打斷的mRNA片段用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄出第一鏈的cDNA，再合成出第二鏈，這樣就有了雙鏈cDNA。

• 對雙鏈cDNA末端修復(fù)，加A加接頭。

• 片段選擇，PCR擴增、純化（如果樣本中存在污染物，則需要結(jié)合試劑盒進一步純化）。 注：

4. 這個建庫方法對mRNA的完整性有較高要求，因此如果mRNA發(fā)生降解，那么磁珠只能吸附靠近3'端的mRNA斷片，會在富集階段被洗脫，導(dǎo)致最后數(shù)據(jù)有一定的偏差（在RNA測序質(zhì)控時就能發(fā)現(xiàn)mRNA的3'端以及5'端是否有偏移）。

5. 一般在會測序前對總RNA進行一次質(zhì)檢，根據(jù)電泳質(zhì)檢結(jié)果中的18S和28S（rRNA）兩個峰的高度以及峰的尖度來判斷RNA的質(zhì)量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。

6. 除了mRNA普通文庫構(gòu)建外，還有真核鏈特異性文庫、lncRNA文庫、SmallRNA文庫等

7. 針對一些FF(Formalin-Fixed)樣本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蠟包埋樣本以及原核生物的總RNA中去除rRNA，不適合用上述mRNA建庫方法。需要結(jié)合RiboZero、RiboMinus等來去除，其實是針對rRNA序列進行雜交捕獲去除的原理來去除的。

以上主要參考陳巍學(xué)基因視頻： RNASeq方法及應(yīng)用

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