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Trizol提RNA的步驟、技巧

 小夢想在努力 2020-09-25

 Trizol/Tripure

Trizol/TriPure 試劑適用于從不同的生物樣本(包括人類、動物、植物、酵母、細菌和病毒來源的樣本) 中分離總 RNA 或同時分離RNA、DNA 和蛋白質。

試劑儀器準備

氯仿,異丙醇,75%乙醇(DEPC 水),無 RNase 水或 0.5%SDS, 12000g 高速離心機,聚丙烯離心管,水浴(55-60 度),*密度梯度離心試劑(用于白血細胞提取),*糖原(用于小于10mg 的組織樣本)

勻漿裂解樣品

根據樣品類型的不同,按下表在室溫下完成勻漿裂解操作;樣品體積不能超過Tripure試劑的10%;同時,按建議體積量加入Tripure試劑,保證充分裂解,避免DNA污染。

對高脂肪、蛋白、多糖 、胞外基質的樣品(例如肌肉,脂肪,塊莖類植物等), 需要額外步驟去除不溶性成份。(如果后續還要提取DNA,則省略該步驟)

在此,可以繼續進行實驗,或將勻漿樣品在-80度保存(一月以上)。

溶液相分離

1、 勻漿樣品在室溫下放置5min,使核蛋白復合體充分分解。

2、每1ml Tripure勻漿液中加入0.2ml氯仿,蓋緊離心管。

3、手動劇烈搖蕩離心管15s。

4、室溫下放置2-15min。

5、4度12000g 離心樣品15min。

6、離心后勻漿液分層,最上層是無色的水相,RNA主要分布在其中,約占總體積的50%。

7、傾斜離心管45度,小心吸取上層水相至新的離心管,避免吸取其他各相液體。

8、如果要分離DNA和蛋白,保留剩余液體;有機相可以在4度過夜保存。

RNA沉淀

1、對小量提取的RNA(小于約10^6細胞,或10mg組織),添加入5-10ug 無RNase 的糖原作為共沉淀的載體。

2、每1ml Tripure勻漿樣品,加入0.5ml異丙醇到離心管。

3、室溫放置10min。

4、4度12000g 離心樣品10min。

RNA清洗

1、輕輕吸取上清,加1ml 75%乙醇/1ml Tripure勻漿樣品到離心管。

2、在此, RNA可以-20度保存一年以上。

3、稍微渦旋離心管,4度7500g 離心樣品5min。

4、去上清,真空或敞口干燥RNA 5-10min;避免過分干燥。

RNA 重溶

1、加入20-25ul無RNase的水或0.5%SDS溶液重溶RNA沉淀。

2、槍頭吹打溶液,之后放入55-60度水浴中10-15min。

3、-80度長期保存或進行后續實驗。

RNA產量測定

測定A260nm數值,以公式 A260×稀釋倍數×40= ug RNA/ml 計算RNA含量,以A260nm和A280nm比值確定RNA的純度。

各種樣品預期的RNA產量值  (A260/280 比值大于1.8)

常見問題

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溫馨提示:Trizol提組織RNA,如有用干冰研磨,建議使用丁腈手套哦,相比乳膠材質,丁腈更耐磨,耐酸堿腐蝕。最重要的是多多注意,手套破了趕緊換新的,保護RNA也要保護自己。

聯系方式

廣州聚研生物科技有限公司

4001-147-991(電話/QQ同步

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