近年來，吸入新藥的開發逐漸獲得藥品生產企業的重點關注。對于肺部疾病，因肺泡表面積巨大、血氣屏障較薄、代謝酶較少、血流豐富，藥物可以迅速吸收，吸入藥物更可以直達靶部位，而口服或靜脈途徑給藥后僅不到5%的藥物可到達肺部,全身暴露水平高毒性風險大[1]。口服藥物開發需要滿足Lipinski 五倍率法則，而吸入藥物分子允許低水溶性及低生物利用度[2]，顯示出吸入給藥的獨特優勢。吸入藥物需要藥械配合，在化學、制造和控制（Chemical Manufacturing and Control，CMC）及吸入裝置方面的開發要求高、難度大。非臨床研究中，吸入新藥的毒理實驗及仿制藥的刺激過敏等實驗的氣溶膠發生、試驗操作、結果分析及毒性評價等也存在一系列挑戰。我國的創新一類吸入藥物項目尚少，評價經驗還需要進一步積累。本文結合實際工作中的體驗及對相關問題進行的調研，對吸入藥物非臨床毒性評價的特點進行了梳理，以供研究者參考。
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技術要求
1.1 吸入給藥模式臨床有粉霧劑、氣霧劑、噴霧劑、軟霧劑等不同的吸入劑型，其遞送方式及效率各不相同，臨床給藥方式也各有不同。不同的吸入制劑在非臨床階段可以采用的給藥方式僅有氣管內給藥及吸入給藥，氣管內直接給藥具有給藥劑量精確、用量小的特點，但只適于早期藥效毒理的初步評估，因氣道內給藥時上呼吸道沒有藥物暴露，無法評價其安全性，不適于正式的毒理試驗[3]。對動物吸入給藥可采用全身暴露及口鼻暴露兩種模式，全身暴露模式因為藥物消耗較大、存在非吸入途徑吸收等問題逐漸被人們舍棄，目前一般推薦采用口鼻吸入給藥模式。吸入試驗與其他途徑相比最大的特點在于給藥系統復雜、設備要求高、過程復雜及影響因素多。目前我國還沒有針對吸入藥物非臨床評價的技術要求，國外僅經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）有吸入藥物非臨床試驗技術指南[4]。非臨床研究中要實現準確給藥，通常需要開發動物專用的吸入器以模擬臨床給藥，匹配毒理試驗要求。生物藥吸入制劑對穩定性的要求較高，非臨床試驗中藥物氣溶膠的產生是一個難點。1.2 吸入藥物粒徑吸入給藥過程中，藥物氣溶膠顆粒能否被吸入肺部并在肺部沉積很大程度取決于氣溶膠的空氣動力學粒徑。氣溶膠顆粒的空氣動力學粒徑是顆粒隨氣流運動能力的特征參數，以氣流中具有相同沉降速率的單位密度球形顆粒粒徑表示，用于描述在重力作用下顆粒在氣流中的沉降情況。只有具有足夠小的空氣動力學粒徑的藥物氣溶膠才可能隨著吸氣進入肺部。在大鼠吸入毒理試驗中，當藥物氣溶膠粒徑介于1~4mm 時，隨粒徑增大，口咽部及氣管的氣溶膠沉積量會輕微增加，同時肺部的藥物沉積量相對穩定；當粒徑大于4mm 時，氣溶膠顆粒在口咽部及氣管的沉積量明顯增大，而肺部的沉積量則急劇減少[5]；而當粒徑過小（<1μm）時，氣溶膠則會隨呼氣呼出。粒徑較小的顆粒會主要沉積于肺泡，難以發揮針對氣管的藥效作用。有報道，輕微哮喘患者吸入藥物適合的粒徑應為2.8μm，表明粒徑范圍選擇對不同疾病的重要性。嚙齒類動物的呼吸道解剖結構與人差別較大，導致氣溶膠的沉積分布差別也較大；而犬及非人靈長類肺部的氣溶膠沉積分布特征與人更為接近。在毒理學實驗中，推薦的氣溶膠顆粒空氣動力學中值直徑（median mass aerodynamic diameter，MMAD）數值應介于1~4mm，而幾何標準差（geometric standard deviation，GSD）應介于1.5~3 之間。有藥學研究表明，在吸入毒理學實驗中仍然需要伴隨進行氣溶膠粒徑的檢測，確保藥物氣溶膠可以被動物吸入。氣溶膠空氣動力學粒徑的檢測方法首選基于質量檢測的碰撞法，而其他物理方法需要與碰撞法對比，只有當驗證其適用性后才可用于試驗[4]。目前粒徑檢測的“金標準”是基于高效液相色譜（high performance liquid chromatography， HPLC）等分析方法進行質量計算的級聯碰撞法。激光飛行法屬于光學方法，使用過程中難以區分藥物與輔料，無法做到對活性藥物成分（active pharmaceutical ingredient，API）的準確定量，尤其對于干粉制劑中的輔料乳糖顆粒的結果干擾較大，該方法不適合使用。1.3 遞送劑量與沉積劑量吸入給藥與其他給藥途徑的明顯區別在于，吸入藥物是由動物伴隨呼吸動作主動吸入的，這帶來幾方面的問題：①劑量無法準確定量，只能估算；②動物的狀態與呼吸模式會改變吸入的藥量；③即使估算了遞送劑量，實際吸入的氣溶膠藥物在被吸入后可能緊接著就被呼出，無法完全沉積并被機體利用。吸入實驗中劑量的表述包括遞送劑量和沉積劑量（遞送劑量指氣溶膠經發生后經動物吸入的氣溶膠藥量，沉積劑量指吸入的氣溶膠最終沉積在肺部的藥量）。遞送劑量的計算公式為：Dose=RMV×C×D×F/BW（RMV：動物的每分鐘通氣量，C：吸入氣溶膠的濃度，D：吸入的持續時間，F：可吸入的氣溶膠顆粒比例，BW：體重）。此公式適用于從大鼠到犬等不同的動物。國際吸入毒理學會（AIT）對該公式中的參數進行了規范：RMV=0.608×BW 0.852[6]。與估算法不同，有的實驗室實際檢測動物的每分鐘通氣量，然后代入公式計算，該方法實際操作難度大，設備要求高。對毒理實驗資料中的數據進行分析，實際檢測的每分鐘通氣量用于計算劑量與公式估算的劑量結果接近。為提高給藥劑量，可分別提高氣溶膠濃度或延長給藥持續時間[5]。每個吸入藥物由于處方和發生裝置的差異，能實現的最大氣溶膠濃度各不相同，但通常有一定限度。因此，通過延長給藥時間以最大程度地提高給藥劑量是更現實的做法。出于動物福利的考慮，在重復給藥毒性實驗中，最長的持續給藥時間一般不超過6 h/d[7]。鑒于氣溶膠藥物的不穩定性，吸入毒理學實驗中應對遞送劑量的穩定性進行檢測，定期取樣，計算遞送劑量的偏差范圍。根據OECD 的指導原則，此偏差范圍不應超過20%[7]。藥物的遞送劑量是估算劑量，實際能沉積在肺部的藥量即沉積劑量才更接近起效劑量。沉積劑量除受到動物呼吸頻率、潮氣量、氣道解剖結構及藥物粒徑的影響外，也受到動物種屬因素的影響。不同動物種屬的藥物沉積比例也不同。一般認為，大鼠體內遞送劑量的10%可最終沉積到肺部，而犬體內遞送劑量的25%可實現沉積[8]。通常基于這個固定比例對吸入毒理學實驗中的沉積劑量進行粗略估算。沉積劑量并非藥物最終的起效劑量。沉積于肺部的藥物顆粒將面臨黏液-纖毛清除系統的外排作用，有的藥物在吸入后會有80%~90%的藥量被外排至口咽部直至胃腸道[9]，此時胃腸道吸收成為吸入毒理學實驗中伴隨的吸收途徑，只有未被外排的存留藥物經溶出并被吸收后才能進入機體真正起效。臨床上可以采用令患者吞服活性炭的方法來檢測藥物經胃腸道的吸收情況；但在非臨床吸入毒理學實驗中，存留劑量由于受到藥物顆粒的分布、溶出及氣道生理狀態等因素的影響，實際上難以估算。準確給藥是吸入毒理實驗的首要條件。要實現給藥劑量的準確與均一，在實踐中需要：①進行充分的預實驗，對受試物氣溶膠的發生特點有充分了解，準確控制影響參數；②實驗前對動物進行充分馴化，令其熟悉接受吸入給藥的保定環境，減少給藥過程中的應激，對于不適應的動物要及時剔除；③實驗過程中進行密切的濃度檢測、環境檢測，對任何可能導致異常的因素及時修正。1.4 環境參數藥物氣溶膠是一個處于持續變化中的不穩定體系。在給藥過程中維持穩定的藥物氣溶膠持續遞送對準確給藥非常關鍵，但不能確保準確給藥。氣溶膠藥物是經由動物主動吸入的，而動物的自主呼吸容易受環境因素影響，如在應激情況下動物呼吸模式可能淺而快，而在安靜狀態下通常慢而深，不同的呼吸模式會導致吸入的氣溶膠的量產生差異。這種動物的個體差異通常無法有效監測，可能對試驗結果帶來影響。在口鼻吸入模式下，動物受到強制保定，應激反應較大，可能改變呼吸模式。異常的溫濕度，過低的氧氣或過高的二氧化碳，均易導致動物呼吸模式改變，進而改變給藥劑量。為解決上述問題，①需要在實驗前對動物進行馴化，令動物熟悉保定條件，減少應激；②需要在給藥過程中監測各種環境參數，確保溫度、濕度、氧氣、二氧化碳等參數處于適當范圍，確保在設定的保定條件下無異常環境應激。內容由凡默谷小編查閱文獻選取，排版與編輯為原創。如轉載，請尊重勞動成果，注明來源于凡默谷公眾號。
