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翻譯后修飾(PTMs)，如磷酸化、乙酰化、sumo化、泛素化等，可使蛋白質組的復雜性大大增加。PTMs在信號轉導、蛋白穩定和轉換、蛋白識別和相互作用、空間定位等方面發揮著重要作用。由于PTM在基礎生物學和疾病發病機制中的重要性，識別每個靶蛋白(protein of interest：POI)的PTM調節機制具有重要意義。 對于新入門的小白，下圖可以幫你快速入手PTMs相關研究：
 基于免疫沉淀（IP）實驗的技術
免疫沉淀(IP)PTMs研究中的主要實驗方法，IP法允許研究者在目標POI上富集特異性、低豐度的PTM修飾，富集是通過親和純化技術實現的。
附著在固體支撐基質(如瓊脂糖樹脂)上的抗體(或特異性結合分子)與POI或PTM結合，而復合物裂解液中的非靶向蛋白不會被捕獲并通過洗滌步驟去除。然后，用洗脫緩沖液將富集的蛋白質從瓊脂糖珠中除去，并在分離成濃縮溶液。分離的溶液通過其他實驗方法進行分析，如western blot（WB）或質譜，以確定POI是否在翻譯后修飾。 圖1顯示了IP實驗的基本步驟： 
圖1. 免疫沉淀PTM修飾蛋白的一般性實驗流程。 實驗成功Tips：
1. 選擇合適的親和試劑:
高質量的親和試劑是研究低豐度PTM修飾的關鍵
- 利用PTM親和試劑，捕獲想要研究的PTM
- 能夠研究PTM內源性變化的PTM試劑是有益的
- PTM IP vs.靶蛋白IP富集(見下文)
- 抗體與親和基質結合會顯著減少重鏈和輕鏈浸出 2. 選擇合適的裂解液系統:
大多數研究人員使用非變性裂解緩沖液(例如RIPA)。然而，在某些情況下，需要使用替代緩沖液; 例如，當試圖分離像組蛋白（Histones）這樣的DNA結合蛋白時。
- 選擇合適的緩沖系統可能會對陽性或陰性的PTM識別產生影響
- 舉個例子，sumo化需要在變性緩沖系統中研究
- 其他PTMs會更穩定，但也可能受益于變性條件 3. 選擇合適的抑制劑:
- PTM抑制劑是一種添加到裂解緩沖液中的化學物質，用于抑制針對特定PTM的異肽酶(例如去泛素酶抑制劑)。
- 識別關鍵的抑制劑對于成功檢測瞬態PTMs至關重要。
- 當研究多個PTMs時，在裂解緩沖液中補充抑制劑是很重要的，而且可能需要單獨驗證兩種結果，以確保抑制劑混合物沒有交叉反應性。
4. 選擇合適的對照珠子:
- 對照珠可以讓研究人員區分真正的PTM信號，或者非特異性結合親和基質的“粘性”蛋白的假陽性信號。
- 適當的對照珠有IgG抗體結合到珠，以最佳的復制條件，任何非特異性的相互作用將被檢測。
- 適當的控制珠也可以用于裂解液的預清除。相關例子在文章《Signal-SeekerTM翻譯后修飾（PTMs）試劑盒：實驗優化Tips及常見問題》中有更多呈現，詳情請見文末。
5. 選擇合適的對照:
合適的對照可以讓研究者更容易地推斷他們的結果。
- 對照實驗包括陽性對照和陰性對照，這對結果的準確推斷很重要
- 根據文獻中的信息，可以確定感興趣的目標蛋白被修飾或未被修飾的條件
- 其中一種陰性對照的方法是：在沒有PTM抑制劑的緩沖液中裂解細胞，這應該會導致信號減弱或缺失。
- 一篇與PTM修飾蛋白相關的文獻可供參考，在沒有PTM抑制劑的情況下，修飾會減少。（Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton）
- 另一個重要的對照是HRP標記的針對靶PTM的泛抗體。 這可用于評估PTM的富集水平。 6. 選擇合適的檢測方法:
盡管比色和熒光檢測方法可以給你所要研究的靶蛋白提供敏感、線性的WB信號,我們強烈建議使用超靈敏化學發光檢測試劑,因為它的敏感度通常是熒光檢測法的10倍，比色法的20倍。
7. 選擇合適的一抗:
高質量的一抗非常重要。
- 不要使用高背景的一抗
- 要使用敏感性高的一抗
- 使用多種抗體進行信號驗證是更有利用實驗準確結果的獲得。
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