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期刊：Plant Science 影響因子：5.363 發表時間：2022 樣本類型：果皮 客戶單位：南京農業大學 凌恩生物客戶南京農業大學吳俊團隊發表在《Plant Science》上的文章“DNA methylation reprogramming provides insights into light-induced anthocyanin biosynthesis in red pear”，本研究闡述了光誘導下梨果皮中DNA甲基化和基因表達的變化以及兩者之間的相關性，這些結果為光誘導花青素生物合成中DNA的甲基化機制提供了新的見解。 一、研究背景 DNA甲基化是一種表觀遺傳標記，認為能夠調節植物花青素的生物合成。眾所周知，光誘導花青素積累，套袋處理通常用于研究光控制的花青素生物合成。目前關于光誘導花青苷積累的研究主要集中在轉錄因子對結構基因的調控，而基因組水平的DNA甲基化的動態景觀尚未得到很好的表征。本研究對中國沙梨品種“云紅一號”采用套袋（取樣前果實在連續黑暗下生長）和除袋（取袋后果實再暴露在陽光下）處理，并進行了甲基組分析和RNA測序。基于此研究的結果和前人的研究結果，作者提出了光誘導花青苷積累的調控模型（如下圖）。1、套袋和除袋處理梨果實顏色變化及整體甲基組分析 梨品種“云紅一號”的果實在開花后35天（DAFB）套袋，直到200 DAFB（收獲前10天）除袋，除袋后果實皮顏色變紅（圖2A）。隨著光照時間的延長，除袋后果實的花青素含量逐漸增加（圖2B）。分別對除袋后不同時間下樣本（D1、D2、D3）和相應時間下（B1、B2、B3）仍套袋處理的樣本，進行全基因組甲基化測序（WGBS）。研究發現，上下游區CHG和CHH甲基化水平均高于基因體（gene body）（圖2C）。CG甲基化水平在轉錄起始位點和轉錄終止位點（TSS和TTS）附近較基因體以及上游和下游區域降低。DNA甲基化被認為是轉座因子（TE）活性的最典型的調節因子，因此，本研究進一步分析了它們在光誘導的花青素積累過程中的甲基化狀態，結果表明，在這三種情況下，TE區域的甲基化水平都高于它們的側翼區域（圖2C）。圖2 DNA甲基化分析結果。A.“云紅一號”套袋及除袋后果實的表型。B.“云紅一號”套袋及除袋后果實的花青素含量。C. mCG、mCHG和mCHH鄰近基因和TEs的DNA甲基化分析。D. DMR、TEs和基因的密度圖。E. 三種情況下DMRs的DNA甲基化狀態。F. 不同比較中DMRs的數量。G. 在不同的光照條件下，重疊或唯一的DMRs的數量。2、光再暴露誘導花青素生物合成過程中甲基化的再分布模式甲基化水平和低甲基化和高甲基化DMRs （hypod - DMRs和hyperd - DMRs）的數量表明，光再暴露誘導花青素生物合成過程中甲基化狀態的重新分布，尤其是在mCHH（圖2E）。染色體上甲基化水平的分布表明，套袋組CHH明顯發生高甲基化。進一步的研究表明，在套袋組中，CG和CHG環境中的甲基化水平在商業成熟時下降。三個著色階段的CG和CHG沒有重疊。只有少數CHH-DMRs在不同的階段中共享，分別為59個和84個（圖2G）。3、DMR介導的DEGs參與了光誘導的花青素生物合成 對來自套袋和除袋處理的果皮樣本進行轉錄組測序。相對于套袋組，除袋組樣本（D1、D2和D3）共鑒定出2957個、3529個和3596個上調基因，1818個、3141個和3340個下調基因（圖3A）。三組共有DEGs 2568個，其中上調表達基因1714個，下調表達基因805個（圖3B）。通過對DEGs的熱圖聚類分析，2545個DEGs根據其表達模式分為三個聚類，顯示了整體轉錄組的變化（圖3C），以上結果表明，這些基因的差異轉錄水平與甲基化水平的波動密切相關。采用Pearson相關系數的計算結果來評價甲基化水平動力學與轉錄本水平變化之間的關系。在三次比較中，共鑒定出310個DMR介導的基因在共同的DEGs中重疊，其中包括217個含有低甲基化啟動子的上調DEGs和93個含有高甲基化啟動子的下調DEGs。310個DMR介導的DEGs的甲基化組和轉錄組水平之間的相關性熱圖顯示，DMR介導的DEGs的甲基化水平與其表達水平呈負相關。 4、PyUFGT在除袋果實中表達水平的增加是由于啟動子區域的低甲基化PyUFGT酶是一種重要的糖基轉移酶，有報道稱它可以催化不穩定的花色素轉化為花青素，這對于梨顏色的穩定性至關重要。PyUFGT（Pbr001279.1）在310個DMR介導的DEGs中被發現。PyUFGT屬于一組具有低甲基化啟動子的上調基因（圖4A），在除袋水果中表達增加（D1、D2、D3）。根據WGBS的分析結果，在PyUFGT啟動子區域發現了一個DMR（圖5A）。以該基因為代表，對PyUFGT啟動子進行BS-PCR，并計算甲基化率。除袋后，PyUFGT啟動子在?2689~?2190 bp區域的甲基化水平較低，甲基化環境為“mCHH”（圖5B，C）。同時，與套袋水果相比，脫袋果皮中PyUFGT的表達明顯增加（圖5C）。因此，光誘導花青苷生物合成過程中的糖基化可能受到甲基化的影響。圖5 PyUFGT啟動子的甲基化分析及5?-Aza處理對花青素生物合成和甲基化修飾相關基因表達模式的影響。為了研究套袋和除袋果皮中DNA甲基化水平的差異是由DNA甲基轉移酶還是去甲基化酶引起的，對這些酶的基因表達譜進行了分析。通過基因組注釋和轉錄組分析，在梨中分別鑒定出擬南芥的同源基因，包括2個PyDRM1、1個PyDRM2、1個PyMET1、2個PyROS1和7個PyDMEs。PyDRM1、PyDRM2和PyMET1在袋裝果實中的表達量普遍較高。此外，PyDRM1在B3中表達量最高，而PyDRM2和PyMET1在B1中表達量最高（圖5D）。DNA去甲基化酶同源物PyROS1和PyDME在除袋早期（D1或D2）的表達水平顯著升高。5?-Aza是一種核苷抑制劑（胞苷的核苷類似物），有助于表觀遺傳變化，將“云紅一號”套袋果實注射5?-Aza，作為平行實驗，梨愈傷組織在5?-Aza固體培養基上處理梨愈傷組織。處理結果表明，5?-Aza誘導了梨皮和愈傷組織的紅色色素沉積，而模擬對照和空白對照均沒有誘導（圖5E、F）。本研究分析了不同條件下梨果皮著色時的DNA甲基化變化，在除袋處理和套袋處理之間，基因體/TE及其側翼序列的DNA甲基化水平大致相似，但在光照后，甲基化差異區域（DMRs）重新建立。DNA去甲基化酶同源物和RNA定向的DNA甲基化（RdDM）途徑都促成了這種重新分布。在套袋處理和除袋處理的光誘導花青素生物合成過程中，共有310個DEGs與DMR相關。在PyUFGT的啟動子中可以看到低甲基化的mCHH環境，以及其他花青素生物合成基因（PyPAL、PyDFR和PyANS）。這增強了轉錄激活，促進了再次光照后花青素的積累。本研究觀察了甲基化模式的全基因組再分布，表明芽突變或環境變化引起的花青素甲基化模式的不同機制。參考文獻 DNA methylation reprogramming provides insights into light-induced anthocyanin biosynthesis in red pear. Plant Science, 2022.
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