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表觀遺傳調控，包括DNA甲基化、RNA修飾和染色質重塑等，在神經退行性疾病中起重要作用。DNA甲基轉移酶1（DNMT1）是一種已知的DNA甲基轉移酶，主要負責維持DNA甲基化。然而DNMT1在非分裂細胞中的功能尚不清楚。此外，DNMT1的RFTS（replication focus targeting sequence ）結構域突變（如A560V）與多種神經退行性疾病相關，但其分子機制尚未完全闡明。

近日，美國加州大學洛杉磯分校終身教授/上海科技大學免疫化學研究所特聘教授范國平課題組揭示了 DNMT1在調控DNA和RNA甲基化中的雙重作用，特別是其通過RNA修飾調控線粒體功能的機制。研究發現，DNMT1能夠與mRNA結合并促進其穩定性，并通過招募NSUN2蛋白來調節RNA的5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基化。此外，研究還發現DNMT1的RFTS結構域突變（如A560V）會導致代謝基因的RNA甲基化和穩定性異常，進而引發線粒體功能障礙和神經退行性疾病。這些發現為理解DNMT1在神經系統疾病中的作用提供了新的視角，并為開發靶向RNA甲基化的治療策略提供了理論基礎。相關研究成果以《DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m5C RNA methylation》為題發表于《Molecular Cell》期刊。易基因科技為本研究提供m5C甲基化測序RNA-BS-seq技術服務。

文章標題：DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m5C RNA methylation

發表時間：2025-05-05

發表期刊：Molecular Cell

影響因子：IF14.5/Q1

技術平臺： RNA-BS-seq、RRBS、RNA-seq等（易基因金牌技術）

DNMT1是一種維持DNA甲基化的DNA甲基轉移酶。其復制焦點靶向序列（RFTS）結構域中的點突變會導致晚發性神經退行性疾病，如常染色體顯性小腦性共濟失調-耳聾和嗜睡癥（ADCA-DN）疾病。本研究首先驗證了DNMT1具有結合mRNA轉錄本的功能，并通過招募NOP2/Sun RNA甲基轉移酶2（NSUN2）來促進RNA m5C甲基化。同時，RNA m5C甲基化增強那些調節線粒體功能基因的RNA穩定性。當小鼠的DNMT1 RFTS結構域發生突變時，會引發異常的DNMT1-RNA相互作用，并顯著提高部分代謝基因的m5C RNA甲基化和RNA穩定性。因此，代謝RNA轉錄本水平增加導致了累積性的氧化應激、線粒體功能障礙和神經癥狀。總體而言，本研究結果揭示了DNMT1在調節DNA和RNA甲基化中的雙重作用，并進一步調節了線粒體功能，為DNMT1突變誘導的神經退行性疾病的發病機制提供了新見解。

圖形摘要

研究方法

1. 細胞培養和基因編輯

細胞培養：使用HeLa細胞、HEK293T細胞以及小鼠胚胎干細胞（ESCs），并在特定條件下培養。

基因編輯：通過CRISPR-Cas9技術構建了攜帶Dnmt1A560V突變的小鼠模型和細胞系。

2、動物模型和行為學測試

小鼠模型：構建Dnmt1A560V突變小鼠模型，用于研究DNMT1突變對神經系統的長期影響。

行為學測試：包括后肢抓握測試和旋轉桿測試，評估小鼠的運動功能障礙。

3. RNA結合蛋白分析

增強型交聯免疫沉淀測序（eCLIP-seq）：鑒定DNMT1結合的mRNA轉錄本（DNMT1-bound mRNA transcripts，DBTs），發現DNMT1能夠結合大量mRNA，并影響其穩定性。

4. RNA甲基化分析

RNA-BS-seq：分析RNA m5C甲基化水平，發現DNMT1能夠通過招募NSUN2蛋白來調節RNA的m5C甲基化。

質譜分析（UHPLC-MRM-MS/MS）：定量分析RNA甲基化水平，驗證DNMT1對m5C甲基化的調控作用。

5. 蛋白質互作分析

Co-IP：檢測DNMT1與NSUN2互作，并通過質譜分析鑒定DNMT1的互作蛋白。

等溫滴定量熱法（ITC）：檢測DNMT1與NSUN2之間的結合親和力。

6. 基因表達和表觀遺傳分析

RNA-seq：分析基因表達變化，發現Dnmt1A560V突變導致代謝基因表達失調。

DNA甲基化測序（EM-seq和RRBS）：分析DNA甲基化水平，發現突變對DNA甲基化影響較小，但對RNA甲基化影響顯著。

7. 單細胞分析

scRNA-seq和snRNA-seq：分析神經組織中不同細胞類型的基因表達變化，揭示了廣泛的氧化應激反應。

8. 代謝和線粒體功能分析

細胞能量代謝分析：評估細胞的氧氣消耗率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）。

線粒體DNA含量測定：通過qPCR分析線粒體DNA含量。

氧化應激和ATP含量分析：檢測細胞中的氧化應激和ATP水平。

結果圖形

（1）DNMT1直接與mRNA結合以增強其穩定性

DNMT1能夠與mRNA結合，并通過增強RNA穩定性以調控基因表達。通過eCLIP-seq技術，研究者在HeLa細胞和HEK293T細胞中鑒定出大量DBTs，這些轉錄本主要分布在5’UTR區域。DNMT1的結合顯著增強了這些mRNA的穩定性，且這種穩定性與RNA的細胞核質比和翻譯效率相關。

圖1：DNMT1與參與轉錄后調控的部分mRNA結合

（2）DNMT1通過招募NSUN2調控DBTs的m5C RNA甲基化

DNMT1能夠通過招募NSUN2蛋白來調節RNA m5C甲基化。通過免疫共沉淀實驗和質譜分析，研究者發現DNMT1與NSUN2之間存在直接相互作用，且這種相互作用部分依賴于RNA。RNA-BS-seq分析顯示，DNMT1敲低（KD）的細胞中m5C水平顯著降低，且這些位點與DBTs高度重疊。

圖2：DNMT1對mRNA上m5C RNA甲基化的調控

1. 鑒定DNMT1相互作用蛋白的FLAG免疫沉淀（IP）實驗方案，隨后進行質譜（MS）分析。

2. 在IP-MS實驗中，通過質譜檢測到的DNMT1相互作用肽段與非特異性肽段（僅EGFP）的豐度差異。

3. 在HeLa細胞中異位表達全長NSUN2和FLAG標簽的DNMT1。隨后使用抗FLAG抗體進行染色質裂解液的IP。然后用抗NSUN2和抗DNMT1抗體對IP蛋白進行免疫檢測。

4. DNMT1結構域和FLAG-DNMT1分離片段（F1–F4）的示意圖。

5. 共免疫沉淀檢測FLAG-DNMT1分離片段（F1–F4）與NSUN2的相互作用。

6. RNA-BS-seq熱圖顯示在HeLa細胞中鑒定出的依賴DNMT1的m5C位點。

7. DBTs與含有DNMT1依賴性m5C位點的基因之間的重疊。

8. 由于DNMT1敲低（KD）處理而在HeLa細胞中穩定性發生變化的轉錄本的鑒定。

9. DBTs與因DNMT1 KD而RNA穩定性降低的基因之間的重疊。

10. 對照組（Ctrl）和DNMT1 KD HeLa細胞中DBTs（左側）和非DBTs（右側）的RNA穩定性條形圖。

11. 對照組（Ctrl）和DNMT1 KD HeLa細胞中所有DBTs的RNA穩定性總結。

12. 對含有DNMT1依賴性m5C位點的DBTs進行GO分析。

13. 基因組軌跡顯示在對照組和DNMT1 KD HeLa細胞中Slam-seq信號在SPG7上的分布。

（3）Dnmt1A560V突變小鼠出現代謝和神經系統疾病

Dnmt1A560V突變小鼠表現出多種代謝和神經癥狀，包括體重下降、運動功能障礙和氧化應激增加。這些癥狀與線粒體功能障礙相關，且在突變小鼠的多個組織中觀察到代謝基因的RNA甲基化和穩定性顯著增加。

圖3：Dnmt1A560V小鼠表現出代謝和神經紊亂

1. Dnmt1結構域示意圖及ADCA-DN A560V突變的位置。

2. 部分純合突變（Hom）小鼠表現出圓頂狀頭顱的腦積水（上）。整體大腦顯示出擴大的大腦半球、受壓的嗅球和下陷的大腦皮層（下）。

3. 代表性大腦矢狀面（上）和冠狀面（下）切片顯示，與野生型（WT）小鼠相比，Hom突變小鼠的側腦室（LVs）極度擴張，且大腦皮層變薄。

4. 本研究中鑒定出的WT、Het和Hom小鼠的總數和腦積水小鼠的數量。

(E-F) 雄性小鼠（每種基因型n=20）（E）和磁性小鼠（每種基因型n=20）（F）的生長曲線。

(G) 本研究中三種基因型的白內障發病率。

(H-I) 三種基因型小鼠的后肢抓握評分，雄性（H）和雌性（I）。

(J-K) 6個月大雄性（J）和雌性（K）小鼠的旋轉桿性能測試。

（4）Dnmt1A560V突變顯著增加代謝mRNA轉錄本水平

在Dnmt1A560V突變小鼠細胞中，代謝基因的mRNA轉錄本水平顯著增加。這些轉錄本的增加與RNA m5C甲基化水平升高相關，表明DNMT1突變增強了RNA甲基化和穩定性。

圖4：Dnmt1點突變導致部分代謝基因的轉錄去抑制

1. hDNMT1蛋白對DNA的甲基轉移酶活性的發光檢測。

2. 不同小鼠組織中基因體的平均甲基化水平。CB，小腦；Cor，皮層；M，月齡。

3. 不同樣本中高甲基化和低甲基化DMRs比例。

4. 最接近DMRs基因與DBTs的重疊。

5. 皮層中與DBT相關的DMRs數量的餅圖。

6. 皮層中與DBT相關的DMRs的甲基化差異（左）和相應的基因表達變化倍數（右）。

7. 鑒定皮層中的差異表達基因（DEGs）。

8. 所有與DBT相關的DEGs的相對表達（左）和皮層中相應TSS±2 kb區域的甲基化水平（右）。

9. 對皮層中與DBT相關的DEGs的TSS±2kb區域中，純合子（Hom）與野生型（WT）之間的DNA甲基化變化比例分析。

（5）穩定化的DNMT1結合mRNA參與線粒體調節

DNMT1結合的mRNA穩定性增加與線粒體功能調節密切相關。研究發現，這些mRNA的穩定性增加導致代謝基因表達水平升高，進而影響線粒體功能和氧化應激反應。

圖5：與線粒體功能相關的DBTs的穩定性

1. hDNMT1蛋白與RNA寡核苷酸R1結合的電泳遷移率變化分析（EMSA）。

2. 與NSUN2和WT或突變型hDNMT1蛋白孵育的RNA寡核苷酸R1的單核苷酸中的RNA m5C含量。

3. 小鼠皮層中DBTs的m5C位點的RNA甲基化水平熱圖。

4. WT、雜合子（Het）和純合子（Hom）神經前體細胞（NPCs）中DBTs的RNA穩定性。

(E–H) 不同組織和細胞中一致上調的DBTs熱圖。

(I-J) 純合子Dnmt1A560V突變在皮層（I）和小腦（J）中誘導的指示基因特征變化基因集富集分析（GSEA）。

（6）失調的DNMT1結合mRNA導致線粒體功能障礙

Dnmt1A560V突變導致DNMT1結合的mRNA失調，進而引發線粒體功能障礙。研究發現，突變小鼠的線粒體呼吸功能下降，ATP合成減少，氧化應激增加，這些變化與代謝基因的RNA甲基化和穩定性異常相關。

圖6：失調的DBTs導致線粒體功能障礙

1. 熱圖顯示不同組織和細胞中線粒體（mt）基因的倍數變化。

2. 與線粒體功能相關的實驗設計圖。

(C-F) 條形圖顯示三種基因型成纖維細胞的線粒體呼吸（C）、ATP相關呼吸（D）、最大呼吸（E）和質子泄漏（F）。

(G-H) 三種基因型成纖維細胞的相對H2O2含量（G）和ATP含量（H）。

1. 條形圖顯示成纖維細胞中線粒體DNA含量。

(J) 條形圖顯示三種基因型大腦皮層的線粒體復合體驅動的呼吸。

(K) 條形圖顯示大腦皮層的線粒體DNA含量。

(L) 12月齡小鼠禁食4小時后的血糖水平。

（7）單細胞分析揭示神經組織中廣泛的氧化應激反應

通過單細胞RNA測序分析，研究發現Dnmt1A560V突變小鼠的神經組織中存在廣泛的氧化應激反應。這些反應涉及多個細胞類型，包括少突膠質細胞和抑制性神經元，表明DNMT1突變對神經系統的廣泛影響。

圖7：單細胞分析揭示神經組織中廣泛的氧化應激反應

1. 單細胞文庫制備示意圖。

2. 基于snRNA-seq的無偏倚UMAP可視化。

3. 皮層中每個細胞亞型的標記物的點圖。

4. 細胞亞型中鑒定出的單細胞差異表達基因（scDEGs）數量及其與神經退行性相關基因的重疊條形圖。

5. scDEGs與神經退行性相關基因的重疊維恩圖。

6. 不同細胞亞型中Klf13b、Klf3a和Sqstm1表達的箱線圖。

7. 所有興奮性神經元中鑒定出的scDEGs的GO分析。

8. 基于UMAP可視化的視網膜中14669個細胞的9個聚類。

9. 視網膜中scRNA-seq和bulk RNA-seq結果一致的差異表達基因（DEGs）的GO分析。在scRNA-seq和bulk RNA-seq中表現出一致變化趨勢的DEGs被定義為一致DEGs。

10. DNMT1調控的DBTs模型。突變導致DNMT1與RNA的相互作用增強，從而導致RNA過度抑制DNA甲基化（轉錄水平）和通過m5C RNA甲基化增強轉錄本穩定性。轉錄去抑制和DBTs的RNA甲基化共同驅動線粒體功能障礙，而ATP缺失和累積的氧化應激最終導致代謝和神經障礙。

易小結

本研究揭示了DNMT1在RNA修飾和線粒體功能調節中的新功能。DNMT1通過招募NSUN2調節RNA m5C甲基化，進而影響線粒體功能和神經退行性疾病發生。這些發現為開發靶向RNA甲基化的治療策略提供了新的靶點，并為理解DNMT1在神經系統疾病中的作用提供了新視角。

RNA-BS-seq分析在本研究中的重要作用

RNA-BS-seq技術在本研究中發揮了關鍵作用。它不僅用于分析DNMT1和NSUN2在RNA甲基化中的作用，還揭示了Dnmt1A560V突變對RNA甲基化水平的影響。通過RNA-BS-seq，研究者能夠單堿基分辨率檢測RNA m5C甲基化水平，并鑒定出與DNMT1結合的mRNA轉錄本。這些數據為理解DNMT1在RNA修飾中的作用提供了重要依據。

關于易基因RNA m5C甲基化測序(RNA-BS)技術

m5C是RNA百余種修飾中研究較多的一種。m5C存在于tRNA上時，可以對翻譯進行調節；存在于rRNA上時，可以對核糖體的生物合成進行質控；存在于mRNA上時，則可以影響mRNA的結構、穩定性及翻譯過程。

易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測序技術：

• 常規mRNA m5C甲基化測序（RNA-BS）：
  mRNA分離后首先通過亞硫酸鹽處理，非甲基化的C轉變為U，m5C修飾的堿基保持不變，結合高通量測序，可以對RNA上的每一個C堿基修飾進行定位與定量。

• 常規mRNA +lncRNA m5C甲基化測序（全轉錄組RNA-BS）：

易基因科技建立的升級版m5C RNA甲基化測序服務，去除人rRNA后，剩余RNA經重亞硫酸鹽處理后，結合高通量NGS策略，可在全轉錄組范圍內單堿基分辨率地檢測基因m5C甲基化修飾分布。

技術優勢：

• 高深度：超高深度重亞硫酸鹽處理，檢測準確性極高；

• 高通量：結合高通量NGS，全轉錄組范圍內檢測；

• 單堿基：單堿基分辨率，快速檢測和分析RNA中的m5C。

• 高準確：精確的檢測mRNA等每一個C堿基的的修飾水平。

研究方向：

• 與m6A甲基化類似，m5C甲基化已被證明與腫瘤、神經系統紊亂、代謝性疾病、病毒感染以及個體發育等密切相關。

• 此外，RNA甲基化（m5C）與人類疾病密切相關，其功能涉及調控干細胞應激、細胞毒性應激、mRNA出核和植物細胞發育及基因表達等方面。

易基因提供全面的表觀基因組學（DNA甲基化、DNA羥甲基化、cfDNA）和表觀轉錄組學（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA與蛋白互作）、DNA與蛋白互作及染色質開放性技術方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻：

Wang et al., DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m5C RNA methylation,Molecular Cell (2025), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.04.019

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