Mol Cell | 林水賓博士等揭示tRNA m7G修飾譜新功能

4256735405Li 2019-05-14

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責(zé)編丨迦溆

過去一段時間，關(guān)于mRNA上m6A修飾的相關(guān)研究BioArt進(jìn)行了許多報道，事實上相比于mRNA上的修飾而言，tRNA上的修飾種類更為豐富，然而tRNA上的修飾并沒有很多研究報道（今年2月，芝加哥大學(xué)潘濤教授在Cell Research雜志上發(fā)表了一篇相關(guān)綜述）。

7月5日，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心林水賓博士和哈佛醫(yī)學(xué)院Richard Gregory團(tuán)隊在Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題為The Mettl1/Wdr4 mediated m7G tRNA methylome is required for normal mRNA translation and embryonic stem cell self-renewal and differentiation的研究論文，揭示了m7G tRNA修飾對mRNA翻譯、干細(xì)胞自我更新分化和小頭侏儒癥等發(fā)育相關(guān)疾病的調(diào)控功能和機(jī)理【1】。

近年來，RNA修飾逐漸成為研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)mRNA含有各種不同的表觀遺傳學(xué)修飾，并且這些表觀遺傳修飾可以調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯從而控制基因表達(dá)，并且在組織發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用。與mRNA相比，tRNA具有更加豐富的修飾，并且發(fā)生在tRNA上的多種修飾異常在病人中導(dǎo)致出生缺陷和神經(jīng)發(fā)育異常。例如針對多例病因未知的小頭畸形和智力殘疾侏儒癥嬰兒的外顯子測序發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在tRNA m7G修飾的主要蛋白復(fù)合物成員WDR4外顯子上的突變引起新生兒的神經(jīng)和個體發(fā)育缺陷【2, 3】。tRNA m7G甲基化復(fù)合物主要有甲基化酶METTL1和輔助蛋白WDR4組成。之前關(guān)于tRNA m7G甲基化的研究主要在酵母中進(jìn)行，在酵母里Trm8（METTL1同源基因）和Trm82（WDR4同源基因）的敲除導(dǎo)致tRNA m7G修飾的缺失，但是 Trm8和Trm82敲除在正常條件下對酵母的生長沒有影響。然而在人類中，WDR4突變引起的tRNA m7G修飾異常會導(dǎo)致胎兒新生兒先天性小頭畸形和智力殘疾，這說明在人類等哺乳動物中tRNA m7G修飾對胎兒的正常生長發(fā)育起著重要的調(diào)控。然而，WDR4基因缺陷引起小頭畸形和智力殘疾的分子機(jī)理并不清楚。

雖然新一代測序方法在基因組學(xué)、mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)、mRNA表觀修飾組學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，tRNA的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀修飾組學(xué)方面的研究卻一直非常滯后。這是因為tRNA具有特殊的三葉草形的二級結(jié)構(gòu)和復(fù)雜多樣的RNA修飾，高級二級結(jié)構(gòu)和高豐度的RNA修飾導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄酶不能有效地把tRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所以普通的基于反轉(zhuǎn)錄的高通量測序文庫方法不能有效的用于tRNA測序文庫的構(gòu)建。2015年在Nature Methods雜志同一期發(fā)表的兩篇tRNA高通量測序的方法為研究tRNA表達(dá)提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)【4, 5】。這種新方法利用去甲基化酶AlkB先去除tRNA上面的大部分修飾，然后在高溫情況下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而大大提供了tRNA反轉(zhuǎn)錄效率而實現(xiàn)對tRNA表達(dá)的高通量測序。

為了研究tRNA m7G修飾異常引起新生兒的小頭畸形侏儒癥和智力殘疾的分子機(jī)理，林水賓博士等開發(fā)了兩種基于AlkB去甲基化的描繪tRNA m7G修飾圖譜的高通量測序方法，分別為tRNA m7G 甲基化RNA共沉淀測序(m7G Methylated RNA Immunoprecipitation-Sequence, MeRIP-Seq) 和m7G tRNA 還原和斷裂測序 （m7G tRNA Reduction and Cleavage-Sequence, TRAC-Seq），并成功利用這兩種方法鑒定了胚胎干細(xì)胞中的tRNA m7G甲基化修飾譜。

研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞里有22個不同的tRNA含有m7G修飾，這說明哺乳動物里面m7G tRNA修飾廣泛的存在，為研究m7G tRNA修飾異常導(dǎo)致人類胎兒發(fā)育畸形和智力殘疾的機(jī)理奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究表明METTL1或者WDR4敲除在胚胎干細(xì)胞里面引起tRNA m7G修飾缺陷，mRNA翻譯水平下降，并導(dǎo)致干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)降低和生長增殖下降，說明METTL1和WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾對維持胚胎干細(xì)胞自我更新具有重要作用。誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化實驗表明，METTL1或者WDR4敲除的胚胎干細(xì)胞傾向于往內(nèi)胚層和中胚層分化，而向神經(jīng)系統(tǒng)分化的能力受到嚴(yán)重抑制(下圖)。上述研究在一定程度上解釋了tRNA m7G修飾異常引起小頭畸形和神經(jīng)發(fā)育異常疾病的機(jī)理。

據(jù)悉，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心林水賓博士和哈佛醫(yī)學(xué)院劉琪博士為本文的共同第一作者，哈佛醫(yī)學(xué)院Richard Gregory教授為本文通訊作者。

參考文獻(xiàn)：

1. Lin S, Liu Q, Lelyveld VS, Choe J, Szostak JW, Gregory RI. The Mettl1/Wdr4 mediated m7G tRNA methylome is required for normal mRNA translation and embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Mol Cell.2018 July 19; 71: 1-12.

2. Shaheen, R., et al., Mutation in WDR4 impairs tRNA m(7)G46 methylation and causes a distinct form of microcephalic primordial dwarfism. Genome Biol,2015. 16: p. 210.

3. Trimouille, A., et al., Further delineation of the phenotype caused by biallelic variants in the WDR4 gene. Clin Genet, 2018. 93(2): p. 374-377.

4. Zheng, G., et al., Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods, 2015. 12(9): p. 835-837.

5. Cozen, A.E., et al., ARM-seq: AlkB-facilitated RNA methylation sequencing reveals a complex landscape of modified tRNA fragments. Nat Methods, 2015. 12(9): p. 879-84.