外泌體是胞內體逆出芽形成多囊泡胞內體，多囊泡胞內體與細胞膜融合，向細胞外釋放形成外泌體。幾乎所有的細胞都可以分泌外泌體（直徑30~100 nm），其存在于大多數種類的細胞和多種體液當中，同時也存在于大多數種類細胞的培養液中。

外泌體中包含多種成分，如蛋白質、脂質、RNA，其中RNA種類有：mRNA、miRNA及其他非編碼RNA。

近年來，關于外泌體的研究十分熱門，今天小編就來給大家普及一下外泌體研究中的第一步：如何高效分離外泌體？

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試劑盒提取

近年來，市場上已出現各種商業化的外泌體提取試劑盒，如SBI外泌體試劑盒，Thermo Fisher的Total Exosome Isolation試劑盒等，可快速便捷地從血液樣本中獲得高質量外泌體。這些試劑盒不需要特殊設備，提取效率和純化效果高，受到越來越多研究者的青睞。

小編專門請教了實驗室做外泌體實驗的老司機。老司機推薦了加拿大Norgen公司的外泌體分離與RNA提取試劑盒。這款試劑盒除了具備操作簡單的特點外，能快速純化富集到與超速離心法一樣高質量的外泌體。這款試劑盒的性能，大家看下面四張圖就能一探虛實。

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超速離心法

超速離心法是目前最常用的外泌體純化手段，通過高速離心將大小相同的囊泡從樣本中沉淀并純化出來。外泌體超速離心一般和蔗糖密度梯度離心或蔗糖襯墊組合起來分離低豐度外泌體。需在離心機中以100,000-200,000 x g離心沉淀（含有外泌體）120分鐘，使樣品中的外泌體在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范圍內進行富集。

盡管這種聯合的方法可以獲得高度純化的外泌體，但也存在一些缺點。例如同批次最多只能同時處理6個樣本（轉子限制）且回收率不穩定，前期需要準備大量材料且外泌體得率低。最重要的是重復離心很可能對外泌體的囊泡造成損害從而降低其質量，并且一些可溶性蛋白可與外泌體形成團塊而產生污染。

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超濾離心法

超濾離心法是利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜進行選擇性分離，小分子物質會被過濾到膜的另一側，而大于膜孔徑的高相對分子質量物質則截留在超濾膜上。

這種方法比較簡單高效，也不影響外泌體的生物活性，但缺點是外泌體可能會阻塞過濾孔，導致膜的壽命減短，分離效率較低。此外，截留在膜上的外泌體間也會發生粘附，導致產量降低。

Tips：外泌體是直徑30~100 nm囊狀小體，大于一般蛋白質。采用此方法需要考慮到與外泌體大小相似的其他囊泡的干擾。

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磁珠免疫法

外泌體表面有其特異性標記物（如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相關蛋白Rab-5b，細胞骨架蛋白肌動蛋白和TSG101等），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。因為外泌體的異質性與它們的起源一致，不同外泌體上的標記物豐度也不同，通過特定的抗體組合可以從樣本中捕獲不同類型的外泌體，進行選擇性分離。

磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態完整等優點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

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PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早期應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。在4℃利用PEG孵育后通過過濾或離心即可沉淀、回收外泌體。

采用此種分離方法也存在不少問題：純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等，因此發表文章時易受質疑。

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其他方法（近期文獻報道）

①交流電動（alternating current electrokinetic，ACE）微陣列芯片裝置：簡稱ACE芯片，該芯片的單個電極的側視圖和俯視圖如下所示，一個設備中有超過1000個電極，其表面涂覆薄薄一層多孔水凝膠，圖中虛線所示DEP高場區即外泌體被富集的位置。在芯片電極處被富集的外泌體可直接用掃描電子顯微鏡（SEM）和免疫熒光等方法進行分析與鑒定。

該裝置可以從未稀釋的人血漿樣品中快速分離獲取外泌體，需要的樣品量小，在15分鐘內將外泌體集中到微電極周圍的高場區域。洗滌去除大量血漿物質后，使外泌體濃縮在微電極上。分離、洗滌及芯片熒光分析步驟在30分鐘內就可以完成。

參考文獻：

Ibsen SD, Wright J, Lewis JM, et al. Rapid Isolation and Detection of Exosomes and Associated Biomarkers from Plasma[J]. ACS nano, 2017.

②基于新型聲波流體技術（acoustofluidic technology）開發的聲波篩選裝置：細胞分選裝置由一個微流體通道和兩端的聲換能器組成。兩個聲換能器生產的聲波相互接觸所形成的駐波會生成一系列壓力節點。當細胞或粒子流過通道并遇到一個節點時，壓力會引導細胞稍微偏離中心，細胞位移的距離取決于細胞大小和可壓縮性等其他性質。

為了分離外泌體，研究人員將2個上述裝置串聯。第一個裝置用來去除血液樣本中的細胞和血小板，第二個裝置的聲波頻率較高，可以把剩余血液樣本中的更小的外泌體與稍大的胞外囊膜分離開來。利用這種裝置完成100ml稀釋血液樣本的篩選工作用時不到25分鐘。

參考文獻：

Wu M, Ouyang Y, Wang Z, et al. Isolation of exosomes from whole blood by integrating acoustics and microfluidics.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(40):201709210.

注意事項

①分離exosome 前的樣品不能加入任何RNA保護劑（如Trizol，RNA later）；

②分離好的外泌體如需進行粒徑檢測或流式鑒定，需放4℃保存，并盡快進行實驗；

③不同樣品來源富集到的外泌體含量相差較大，提取RNA總量也相差很大。相對來說，血清、血漿外泌體樣品中外泌體含量較高。

外泌體提取相關方法匯總如上，在開展實驗時可根據實際情況進行選擇哦！

外泌體研究首選芯片的優勢小編已在上期中詳細闡述，

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