一、實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。

1．凝膠色譜法（分配色譜法）：

（1）原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。

（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

（3）分離過程：

混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子

注意：①洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。

②相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)通過擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部。

（4）作用： 分離蛋白質(zhì)，測定生物大分子分子量等。

2．緩沖溶液

（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H₂CO₃/NaHCO₃， NaH₂PO4/Na₂HPO₄等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。

（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。

3．凝膠電泳法：

     電泳：指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。

（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。

（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。

常用方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳：

　　（1）在測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。

　　聚丙烯酰胺凝膠：由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。

　?。?）原理：

　　蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少及分子的大小等因素。加入SDS可消除凈電荷對遷移率的影響，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。

　?。?）SDS作用機(jī)理：

　　SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。

　?。?）用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法

　　使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。

　　電泳檢測結(jié)果：

二、實(shí)驗(yàn)步驟

血紅蛋白

　　在紅細(xì)胞的組成中，約90%是血紅蛋白。它由四個(gè)肽鏈組成，包括兩個(gè)α—肽鏈和兩個(gè)β—肽鏈。每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。

1．樣品處理

①  紅細(xì)胞的洗滌

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。

②血紅蛋白的釋放  

在蒸餾水和甲苯作用下，攪拌后紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。

2．粗分離

①分離血紅蛋白溶液   

將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

②透析   

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。

3．純化

調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝

↓       膠面平齊，關(guān)閉出口。

加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端。加樣后，

∣        打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，

↓        關(guān)閉出口。

調(diào)節(jié)緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度

↓

洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。

↓

收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集。

4.純度鑒定------SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）

三、注意事項(xiàng)

1.  電泳技術(shù)

電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。

2.  紅細(xì)胞的洗滌

如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。

3．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。

此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

4．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？

如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。

5．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的

不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。

6．G-75

“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g。

7．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密

8．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？

防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

9．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義

哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。

10．如何檢測血紅蛋白的分離是否成功

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。