當(dāng)組織細(xì)胞中的氧氣不充足，或供小于需時，即為缺氧。
早在上世紀(jì)90年代，Semenza就發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF1）是缺氧的重要調(diào)控因子。同時，Kaelin發(fā)現(xiàn)了Von Hippel-Lindau 蛋白 (VHL）參與缺氧反應(yīng)的調(diào)控，隨后，Ratcliffe發(fā)現(xiàn)Von Hippel-Lindau 蛋白 (VHL）通過泛素化參與HIF1α的降解。為表彰這三位科學(xué)家在低氧感應(yīng)方向做出的杰出貢獻(xiàn)，2019年授予他們諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
近20年來關(guān)于缺氧研究的文章呈線性增長，尤其是2019年來更是增長迅速。
 

2001-2022年P(guān)ubMed 缺氧相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)

想必大家也更想對缺氧領(lǐng)域進(jìn)行深入了解，今天小優(yōu)也埋頭苦讀了幾天幾夜整理了幾篇高分文獻(xiàn)分別對缺氧的調(diào)控機(jī)制、與其他相關(guān)領(lǐng)域研究關(guān)聯(lián)以及研究思路三個方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述，篇幅有點長，干貨滿滿，建議收藏后再研讀哦！

缺氧調(diào)控機(jī)制
缺氧會激活相關(guān)信號通路，該通路主要受缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 穩(wěn)定性控制。在常氧條件下，HIF-α 亞基的脯氨酸殘基被氧依賴性脯氨酰-4-羥化酶 (PHD) 羥基化。 Von Hippel-Lindau 蛋白 (VHL) 是一種 E3 泛素連接酶，與羥基化的 HIF-α 結(jié)合并作為 E3 泛素連接酶復(fù)合物的底物識別組分，導(dǎo)致 HIF 蛋白降解。HIF-α 亞基的天冬酰胺殘基也被抑制 HIF 的因子羥基化(FIHs)，它抑制 HIF 與共激活劑 p300/CREB結(jié)合蛋白的結(jié)合。缺氧狀態(tài)下，PHDs 和 FIHs 的活性受到抑制，HIF-α亞基易位進(jìn)入細(xì)胞核與 HIF 1β（HIF1B）結(jié)合形成異源二聚體，異二聚體 HIF-α：HIF-1β 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物然后定位到靶基因的缺氧反應(yīng)元件 (HRE)，導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)。這些基因涉及細(xì)胞存活、增殖、運(yùn)動、代謝、pH 調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)功能、炎性細(xì)胞募集和血管生成。

 
HIF作為一個相對上游的事件，通過影響下游通路靶點，進(jìn)而影響不同疾病的發(fā)生。

缺氧與其他相關(guān)領(lǐng)域研究的關(guān)系

缺氧與EMTHIF-1α 可誘導(dǎo)多個 EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子。在前列腺癌和肝細(xì)胞癌中證明，缺氧條件下HIF-1α 驅(qū)動 Wnt/β-catenin對 EMT 的誘導(dǎo)； HIF1α 還可直接與 TWIST 的啟動子（一種 EMT 的誘導(dǎo)劑）中存在的缺氧反應(yīng)元件 (HRE) 結(jié)合，并在乳腺癌細(xì)胞中激活EMT。在 COX-2 和 NF-KB 存在下，HIF-1α 介導(dǎo)的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 的激活已被證明以 ROS 依賴性方式誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞中的 EMT。此外，在腎癌和肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 通過抑制 E-鈣粘蛋白或上調(diào) SNAIL 和 ZEB1誘導(dǎo)不同程度的 EMT 。
 

缺氧與炎癥
在包括慢性炎癥和缺血組織多種病理免疫環(huán)境中，缺氧和炎癥是存在的伴隨事件，
在這些病理狀態(tài)下，組織缺氧導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 途徑的激活，核因子-κB (NF-κB) 通路除了在免疫的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和控制免疫細(xì)胞功能的方面起作用。此外， NF-κB 被炎癥刺激物（如細(xì)胞因子或細(xì)菌產(chǎn)物）激活，也表現(xiàn)出對缺氧的敏感性；缺氧通過這種機(jī)制調(diào)節(jié)病理免疫生態(tài)位中的炎癥基因表達(dá)。此外，HIF 和 NF-κB 通路之間存在廣泛的串?dāng)_。例如，由細(xì)胞因子或細(xì)菌產(chǎn)物驅(qū)動的經(jīng)典 NF-κB 活性增加會促進(jìn) HIF1α mRNA 的轉(zhuǎn)錄，從而在慢性炎癥條件下促進(jìn) HIF 活性；其他因組織炎癥而升高的信號傳導(dǎo)介質(zhì)，也調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的 HIF 活性，從而有助于調(diào)節(jié)免疫和炎癥。

缺氧與代謝
缺氧和HIF信號通路以多種方式影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管生成。一方面，缺氧誘導(dǎo)血管生成基因的轉(zhuǎn)錄激活，同時也在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)促血管生成趨化因子和受體，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移到血管生成部位。而且，VEGF等血管生成生長因子在缺氧時進(jìn)一步穩(wěn)定可增加內(nèi)皮細(xì)胞中的糖酵解通量。此外，缺氧刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和發(fā)芽，并通過細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)血管重塑。在人肝癌和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系中觀察到，血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs ）在缺氧時可能通過 HIF 穩(wěn)定作用上調(diào) PFKFB3酶，進(jìn)一步增強(qiáng)對內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的影響。缺氧除了對ECs的直接影響外，癌細(xì)胞的缺氧還可以向ECs發(fā)出 信號，從而改變其代謝。乳酸在（缺氧）腫瘤環(huán)境中的積累可導(dǎo) 致ECs攝取乳酸，隨后轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)行進(jìn)一步氧化。
 

缺氧與神經(jīng)退行性疾病
遺傳性阿爾茨海默病(AD)危險因素與β淀粉樣蛋白斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞減少相關(guān)，缺氧中HIF1α和HIF1靶基因的上調(diào)，減少β淀粉樣蛋白斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞的覆蓋范圍，進(jìn)而損害了小膠質(zhì)細(xì)胞的活動。當(dāng)這種情況再加上其他系統(tǒng)性疾病（如：心血管疾病）導(dǎo)致的大腦供氧減少時，小膠質(zhì)細(xì)胞就無法提供保護(hù)，與疾病相關(guān)的病理就會增加。

缺氧與基因組穩(wěn)定性
RNA聚合酶II (Pol II)在非缺氧條件下啟動許多HIF靶基因的轉(zhuǎn)錄，但在大約30-60個核苷酸后暫停，需要HIF-1結(jié)合釋放。在低氧乳腺癌細(xì)胞中，HIF-1α 通過組裝多蛋白復(fù)合物響應(yīng)缺氧觸發(fā)釋放暫停的 Pol II，HIF-1招募TRIM28和具有催化活性的dna依賴蛋白激酶(DNA-PK)到HREs，釋放暫停的Pol II，從而刺激轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的延伸。
 

文獻(xiàn)解讀

缺氧條件下葡萄糖剝奪在肝細(xì)胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用

1  人肝癌標(biāo)本中缺氧的存在以及GLUT1、Ki67和EMT相關(guān)靶點的表達(dá)情況
 

圖1 基于18F-FDG攝取的HCC樣本中HIF1α、GLUT1、CD31和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。

 高攝取FDG的HCC患者的HCC組織中腫瘤區(qū)域的hif1-α表達(dá)和膜狀GLUT1陽性區(qū)域明顯增多。在高攝取FDG的HCC患者中，CD31表達(dá)無變化，但腫瘤區(qū)域血管分布不均勻。Ki67的表達(dá)與emt相關(guān)蛋白N-cadherin或vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，EMT相關(guān)蛋白，如N-cadherin或vimentin，在HCC癌細(xì)胞中根據(jù)缺氧條件下的增殖速率而有差異表達(dá)。

2  缺氧敏感HepG2細(xì)胞在缺氧條件下增殖和EMT的失調(diào)。
 

圖2 缺氧相關(guān)蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

為研究氧濃度依賴性變化，HepG2細(xì)胞在0%、1%、3%和21%的氧濃度下培養(yǎng)24 h。缺氧條件下(3%氧及以下)，HIF1 α表達(dá)上調(diào)。增殖指標(biāo)PCNA的表達(dá)在1%和0%氧氣條件下降低。與PCNA不同，糖酵解相關(guān)蛋白HK2和GLUT1的表達(dá)隨著氧濃度的增加而不斷增加(圖2A)。在嚴(yán)重缺氧(低于1%氧)條件下，Snail/Slug蛋白表達(dá)上調(diào)。輕度缺氧(3%和1%氧)時N-cadherin表達(dá)增加。因此，確定了缺氧對體外葡萄糖代謝和增殖相關(guān)蛋白的影響。

3  缺氧對hepg2異種移植模型中Ki67、GLUT1和EMT表達(dá)的影響
 

圖3GLUT1在壞死區(qū)的表達(dá)

在hepg2異種移植模型中，觀察到在缺氧區(qū)GLUT1表達(dá)上調(diào)，并且在一些壞死區(qū)連續(xù)表達(dá)(圖3A)。本研究將HepG2細(xì)胞在零氧無氧環(huán)境下培養(yǎng)3天。缺氧1 d后，hif1 α表達(dá)增加，而隨著缺氧培養(yǎng)時間的延長，hf1α的表達(dá)減少，GLUT1的表達(dá)增加。因此，在壞死區(qū)GLUT1的表達(dá)是陽性的( 圖 3B , C )。通過體外結(jié)合實驗測定了放射標(biāo)記的葡萄糖在HepG2細(xì)胞中的攝取，在缺氧狀態(tài)下，放射性葡萄糖的攝取持續(xù)了3天(圖3D )。因此，GLUT1的表達(dá)可能不是誘導(dǎo)EMT過程的一個充分標(biāo)志。

4  缺氧缺糖條件下EMT相關(guān)蛋白的協(xié)同表達(dá)。
 

圖4 缺氧缺糖后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)增加

在體外研究了缺氧條件下葡萄糖和缺氧對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的協(xié)同作用。如預(yù)期的那樣，在1%氧濃度下，嚴(yán)重的糖剝奪可增加N-cadherin和Snail/Slug的表達(dá)，表明糖剝奪和缺氧協(xié)同增加EMT相關(guān)蛋白。

5  缺氧和增殖條件下EMT相關(guān)蛋白的協(xié)同表達(dá)。
 

圖5 低氧條件下低增殖細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)增加

有趣的是，與高糖HCC細(xì)胞相比，葡萄糖濃度為0 mM和0.1 mM的HCC細(xì)胞中PCNA含量下降(圖4A)；在HepG2和Hep3B細(xì)胞中敲除PCNA后，在完全缺糖的缺氧條件下，N-cadherin和Snail/Slug的表達(dá)顯著增加（圖5A）。因此，HCC細(xì)胞的增殖在誘導(dǎo)EMT過程中也起著重要作用。Ki67的表達(dá)隨距壞死區(qū)的距離而變化（圖5B）。與體外實驗相似，觀Ki67與N-cadherin或vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，缺氧性條件下的葡萄糖剝奪可有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)EMT相關(guān)蛋白。本研究揭示了一個獨(dú)特的微環(huán)境，包括缺糖、缺氧和低增殖率誘導(dǎo)EMT過程。
意義：本研究發(fā)現(xiàn)，EMT過程非常復(fù)雜，是由缺氧、細(xì)胞增殖低和葡萄糖擴(kuò)散不良共同引起的。 這些發(fā)現(xiàn)在 PET 分析期間的臨床實踐中可能非常有用，可用于預(yù)測轉(zhuǎn)移的預(yù)后和治療結(jié)果。

缺氧通過HIF1破壞阿爾茨海默病小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體代謝
 
1 HIF1介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)途徑在A β AM中被誘導(dǎo)-
 

圖1 HIF1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄在AβAM中被激活

AD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Hif1a mRNA在Aβ斑塊周圍表達(dá)(圖1a )。采用轉(zhuǎn)錄因子富集分析發(fā)現(xiàn)，HIF1 α和HIF2 α是小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子( 圖 1c )的前兩個蛋白，表明HIF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄在β淀粉樣蛋白斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（Aβ AM)中發(fā)揮著重要作用。通過差異表達(dá)基因進(jìn)行主成分分析，確定差異表達(dá)基因(圖1d），并在原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中使用誘導(dǎo)型Cx3cr1 Cre:：ERT2介導(dǎo)的Hif1a缺失證明HIF1對其進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖1e，f）。

2 AD小膠質(zhì)細(xì)胞氧化磷酸化(OXPHOS)相關(guān)轉(zhuǎn)錄增加。
 

圖2 AD小膠質(zhì)細(xì)胞增加有氧呼吸相關(guān)轉(zhuǎn)錄

在APP和TAU神經(jīng)退行性小鼠模型中，OXPHOS基因組顯著富集，包括上調(diào)所有線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物(復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ)和復(fù)合物V( ATP酶) 編碼蛋白的基因m RNA水平。這些數(shù)據(jù)被其他與有氧呼吸和ATP生成相關(guān)的基因富集所證實(圖2b)。為了證實本研究結(jié)果也與人類疾病相關(guān)，參考最近一項人類單細(xì)胞RNA測序研究的數(shù)據(jù)。從死后人類AD樣本中分離的小膠質(zhì)細(xì)胞與對照小膠質(zhì)細(xì)胞分析，編碼OXPHOS的基因在AD樣本的小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著過表達(dá)(圖2c)。
而且發(fā)現(xiàn)TREM2缺乏確實與5xfAD / +小鼠模型小膠質(zhì)細(xì)胞OXPHOS基因的顯著下調(diào)有關(guān)(圖2d )，在AD小鼠模型和人類AD小膠質(zhì)細(xì)胞中，有氧呼吸相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以trem2依賴的方式增加。

3 Aβ AM線粒體具有延伸的特征
 

圖3 在AD小鼠模型中線粒體被延伸

通過免疫熒光評估線粒體水平，觀察到與野生型小膠質(zhì)細(xì)胞或Aβ斑塊遠(yuǎn)端小膠質(zhì)細(xì)胞相比，NDUFS2復(fù)合物Ⅰ蛋白在AβAM中明顯上調(diào)(圖3a )。電子顯微鏡觀察了AβAM線粒體的形態(tài)。遠(yuǎn)離Aβ斑塊的小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形線粒體(圖3b )，而AβAM呈粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)復(fù)蓋的長形線粒體(圖3c，3d)；。這些結(jié)果表明，有氧呼吸是神經(jīng)退行性DAM的共同特征，同時HIF1介導(dǎo)的基因表達(dá)的激活和線粒體的伸長提示Aβ AM代謝受損。

4. HIF1的過度激活引起小膠質(zhì)細(xì)胞的靜止
 

圖4缺氧通過細(xì)胞內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞HIF1誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

無論是體內(nèi)、體外，線粒體活性通過oAβ處理上調(diào)。為了表征缺氧在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，首先分析了從暴露于低氧水平，缺氧誘導(dǎo)了一種強(qiáng)勁的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其特征是糖酵解基因的協(xié)同誘導(dǎo)(圖4d)。與此相對應(yīng)的是，在缺氧條件下，原代小膠質(zhì)細(xì)胞的糖酵解率明顯增加(圖4e)，低氧水平抑制線粒體OXPHOS(圖4f-g)。
缺氧24和48小時導(dǎo)致細(xì)胞周期急劇停滯。為了區(qū)分缺氧誘導(dǎo)衰老(不可逆細(xì)胞周期阻滯)或靜止(可逆細(xì)胞周期阻滯)，將BV2缺氧培養(yǎng)物暴露于復(fù)氧24小時。有趣的是，細(xì)胞周期在常氧培養(yǎng)后完全恢復(fù)。為了證實HIF在缺氧介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯中的作用，在缺乏PHD3或半劑量PHD2的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量都有所減少(圖4i)，并且使用缺氧條件下有條件刪除Hif1a的原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)(圖1e)。如預(yù)期的那樣，缺氧使BrdU+細(xì)胞數(shù)量減少約60%。然而，在缺乏HIF1α的培養(yǎng)物中，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖幾乎完全恢復(fù)(圖4k)，這表明HIF1有助于缺氧條件下可逆的小膠質(zhì)細(xì)胞周期阻滯。

5.通過HIF1降低線粒體代謝可降低AβAM 
 

圖5 HIF1的過度穩(wěn)定降低了體內(nèi)的AβAM

VHL缺乏在體內(nèi)誘導(dǎo)了HMM，(圖5b)，OXPHOS基因組轉(zhuǎn)錄下降(圖5c)。流式細(xì)胞術(shù)觀察到，這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控與小膠質(zhì)細(xì)胞百分比的下降有關(guān)(圖5d)。值得注意的是，VHL缺失誘導(dǎo)了共同小膠質(zhì)標(biāo)志(MGnD基因集;圖5e)，提示a β am減少。因此，通過定量a β斑塊周圍的IBA1免疫反應(yīng)性，并觀察到在無VHL時，皮質(zhì)a β沉積的小膠質(zhì)覆蓋減少(圖5f)。總之，這些結(jié)果表明，通過穩(wěn)定HIF1下調(diào)a β am有氧呼吸可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞功能失調(diào)表型。

6.持續(xù)缺氧可增強(qiáng)Aβ局部病理。

圖6 系統(tǒng)性持續(xù)缺氧增強(qiáng)Aβ聚集、擴(kuò)散和Aβ斑塊相關(guān)的軸突營養(yǎng)不良

APP-PSEN1/+小鼠在缺氧和常氧狀態(tài)下皮層Thio-S+和總Aβ+斑塊的大小分布顯示在缺氧狀態(tài)下斑塊富集，提示低氧促進(jìn)Aβ聚集，導(dǎo)致更多新形成的斑塊(圖6a-f)。ELISA法檢測常氧和低氧APP - PSEN1 / +小鼠血清中可溶性Aβ1 - 42的含量，發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，可溶性Aβ1 - 42的含量有增加的趨勢(圖6g )總之，這些數(shù)據(jù)表明，持續(xù)的缺氧增強(qiáng)了Aβ在腦實質(zhì)的聚集和沉積。
APP-PSEN1/+小鼠暴露于持續(xù)缺氧后顯示泛素負(fù)荷增加的趨勢(圖7i)，每個硫代硫+斑塊p-TAU+營養(yǎng)不良神經(jīng)突密度明顯增加(圖6j)，生長抑素(Sst)和神經(jīng)肽Y (Npy)的mRNA水平在持續(xù)缺氧應(yīng)激下進(jìn)一步顯著降低(圖6k)。因此，持續(xù)缺氧導(dǎo)致可溶性Aβ纖維寡聚物和新形成的致密核Aβ斑塊的增加，并加重Aβ斑塊相關(guān)的神經(jīng)退行性現(xiàn)象。

7.缺氧腦區(qū)高病理的裸Aβ斑塊

圖7 人類易缺氧的大腦區(qū)域含有裸體Aβ斑塊，局部軸突營養(yǎng)不良增加

與其他細(xì)胞類型相比，人小膠質(zhì)細(xì)胞中HIF1a的轉(zhuǎn)錄本非常豐富(圖7a )，mRNA (無明顯趨勢)和蛋白水平在AD病理中均上調(diào)。還發(fā)現(xiàn)AD ( Braak V-Ⅵ)人海馬樣品中多個HIF調(diào)節(jié)基因的mRNA水平上調(diào)(圖7c )，提示病理晚期與誘導(dǎo)HIF1有關(guān)。與來自同一個體的瘤周皮質(zhì)的斑塊相比，齒狀回分子層Braak V-Ⅵ期出現(xiàn)了明顯的老年斑小膠質(zhì)細(xì)胞脫群現(xiàn)象(圖7d )，提示局部缺氧也啟動了人AD腦的AβAM功能障礙，生成了裸Aβ斑塊。

意義：本研究結(jié)果也為尋找能夠改善小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體代謝適應(yīng)Aβ斑塊的藥物鋪平了道路，并可能減少AD的進(jìn)展。