5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是哺乳動(dòng)物基因組中最豐富的兩個(gè)表觀遺傳標(biāo)記，已經(jīng)證明，這些雙重表觀遺傳標(biāo)志比單個(gè)標(biāo)記更能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)癌癥的復(fù)發(fā)和存活。然而，由于5mC和5hmC的結(jié)構(gòu)相似且低表達(dá)，區(qū)分和量化這兩種甲基化修飾具有挑戰(zhàn)性。西南大學(xué)卓穎和鐘霞使用十個(gè)十一位易位家族的雙加氧酶（TET）通過特定的標(biāo)記過程將5mC轉(zhuǎn)化為5hmC，實(shí)現(xiàn)了基于納米限制電化學(xué)發(fā)光（ECL）平臺(tái)的兩個(gè)標(biāo)記的識(shí)別，并結(jié)合了重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）輔助的CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的擴(kuò)增策略。得益于TET介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化策略，開發(fā)了一種高度一致的標(biāo)記途徑來識(shí)別隨機(jī)序列上的雙重表觀遺傳標(biāo)記，有效地減少了系統(tǒng)誤差。所提出的生物分析策略可用于分別鑒定和定量100 aM至100 pM范圍內(nèi)的5mC和5hmC，這為早期診斷與異常甲基化相關(guān)的疾病提供了一個(gè)很有前途的工具。相關(guān)工作以“Identification
and Quantification of 5?Methylcytosine
and 5?Hydroxymethylcytosine on Random DNA
Sequences by a Nanoconfined Electrochemiluminescence Platform”為題發(fā)表在國(guó)際著名期刊Analytical Chemistry上。要點(diǎn)1. 作者首先通過制備碳化聚合物點(diǎn)嵌入SiO2納米網(wǎng)絡(luò)建立了ECL平臺(tái)（CPDs@SiO2），由于納米約束增強(qiáng)的ECL效應(yīng)，與散射發(fā)射體相比，其表現(xiàn)出更高的ECL效率和更穩(wěn)定的ECL性能。要點(diǎn)2. 首先，用dsDNA模板特異性標(biāo)記5hmC位點(diǎn)，并通過RPA擴(kuò)增和T7轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化為實(shí)質(zhì)性的RNA激活劑，這將在與crRNA結(jié)合時(shí)觸發(fā)CRISPR/Cas13a的跨切活性，從而不加區(qū)分地切割猝滅探針，導(dǎo)致用于定量5hmC的ECL信號(hào)恢復(fù)。然后，我們使用TET通過一鍋法預(yù)先將5mC氧化為5hmC，以檢測(cè)是否存在5mC位點(diǎn)，然后根據(jù)上述5hmC的標(biāo)記、擴(kuò)增和檢測(cè)步驟，可以獲得由5mC引起的信號(hào)值。要點(diǎn)3. 無論樣品中是否同時(shí)含有5mC和5hmC，都可以在以下過程中進(jìn)行鑒定和定量。該生物分析策略可用于分別鑒定和定量100 aM至100 pM范圍內(nèi)的5mC和5hmC。5mC和5hmC的高度一致的標(biāo)記途徑減少了由不同標(biāo)記途徑引起的系統(tǒng)誤差，不僅實(shí)現(xiàn)了5mC和5hmC檢測(cè)的高準(zhǔn)確性，而且為通過ECL平臺(tái)識(shí)別和量化多個(gè)甲基化位點(diǎn)提供了一種新的方法。圖1.（A）CPDs@SiO2的合成過程示意圖。（B）通過RPA輔助的CRISPR/Cas13a策略將5hmC/5mC位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為二級(jí)靶標(biāo)以及（C）用于5mC和5hmC檢測(cè)的ECL生物傳感器的制造。圖2.（A，B）CPDs和（C）CPDs@SiO2的TEM。（D）CPDs@SiO2完整區(qū)域和（E）Si 2p區(qū)的XPS光譜。（F）CPDs@SiO2可能的結(jié)構(gòu)形成示意圖。圖3.（A）CPDs@SiO2在含有100 mM S2O82-的2 mL PBS溶液中，在-2.0至0 V的電勢(shì)下的三維ECL光譜。（B）CPDs@SiO2的FL（a）和ECL發(fā)射光譜（b）的比較。（C）CPDs@SiO2（a）和CPDs（b）在800 V光電倍增管高壓下的FL光譜（插圖：（a）CPDs@SiO2以及（b）CPDs在365 nm UV光下的圖像）。（D）CPDs（a）和CPDs@SiO2（b）的ECL強(qiáng)度比較。圖4.（A）S1-S2和TN3-T′點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的PAGE圖像。泳道1，正向引物；泳道2，反向引物；泳道3，RPA擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4，S1-S2；泳道5，T-T′；泳道6，TN3-T′；泳道7，S1-S2+T-T′。（B）Fc探針形成的PAGE圖像。泳道1-4分別代表RNA2、S4、S3和Fc探針（所有寡核苷酸的濃度均為1 μM）。（C）TET1的氧化活性。沒有（a）和有（b）TET1蛋白的反應(yīng)的ECL信號(hào)的比較。（D）TET1氧化產(chǎn)物的拉曼光譜。圖5. 生物傳感器在不同濃度（A）5hmC和（B）5mC下的ECL強(qiáng)度-時(shí)間曲線：(a) 100 aM, (b) 1 fM, (c) 10 fM, (d) 100 fM, (e) 1 pM, (f) 10 pM,
(g) 100 pM。不同（C）5hmC和（D）5mC濃度的ECL強(qiáng)度和對(duì)數(shù)值的校準(zhǔn)圖。（E）5hmC生物傳感器平臺(tái)的選擇性：（a）空白，（b）10 pM 5mC-dsDNA，（c）10 pM-c-dsDNA和（d）10 pM
5hmC-dsDNA。（F）5mC生物傳感器平臺(tái)的選擇性：（a）空白，（b）10 pM
C-dsDNA，和（C）10 pM-5mC-dsDNA。Identification
and Quantification of 5?Methylcytosine
and 5?Hydroxymethylcytosine
on Random DNA Sequences by a Nanoconfined Electrochemiluminescence Platform
Mao-Hua Gao, Mei-Chen Pan, Pu Zhang,
Wen-Bin Liang, Xia Zhong,* Ying Zhuo*DOI: https:///10.1021/acs.analchem.3c01252
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